Fluorescenza tecnologie sono il metodo preferito per la rilevazione, la rilevazione analitica, la diagnostica medica, biotecnologie, di imaging e di espressione genica per molti anni. La fluorescenza diventa essenziale per lo studio di processi molecolari ad alta specificità e sensibilità attraverso una varietà di processi biologici. Un problema significativo per le applicazioni pratiche di fluorescenza è l’apparente non linearità dell’intensità di fluorescenza risultante dagli effetti del filtro interno, dallo scattering del campione e dall’assorbimento dei componenti intrinseci dei campioni biologici. L’assorbimento del campione può portare all’effetto primario del filtro interno (effetto filtro interno di tipo I) ed è il primo fattore da considerare. Questo è un fattore relativamente semplice da controllare in qualsiasi esperimento di fluorescenza. Tuttavia, molti approcci precedenti hanno fornito solo metodi sperimentali approssimativi per correggere la deviazione dai risultati attesi. In questa parte stiamo discutendo l’origine dell’effetto filtro interno primario e presentando un approccio universale per correggere il segnale di intensità di fluorescenza nel campo di assorbimento completo. È importante sottolineare che presentiamo i risultati sperimentali diretti di come funziona la correzione. Si considerano i problemi che emergono dal variare dell’assorbimento attraverso il suo spettro di assorbimento per tutti i fluorofori. Usiamo Rhodamine 800 e dimostriamo come correggere correttamente gli spettri di eccitazione in un’ampia gamma di lunghezze d’onda. Il secondo è l’effetto di un assorbitore inerte che attenua l’intensità del fascio di eccitazione mentre viaggia attraverso la cuvetta, che porta a una deviazione significativa dei risultati osservati. Ad esempio, stiamo presentando la tempra a fluorescenza di un analogo del triptofano, NATA, mediante acrilammide e mostriamo come i risultati correttamente corretti si confrontino con i risultati errati iniziali. La procedura è generica e si applica a molte altre applicazioni come la determinazione della resa quantistica, l’assorbimento del tessuto / sangue o l’assorbimento dell’accettore negli esperimenti FRET.
