1. Test di mutazione dell’esone KRAS 2 (codoni 12/13) e dell’esone 3 (codone 61): Test di mutazione Cobas® KRAS per uso diagnostico in vitro (Roche).
Il Cobas® KRAS Mutation Test è un test PCR in tempo reale per la rilevazione qualitativa di mutazioni somatiche nell’esone 2 (codoni 12/13) e nell’esone 3 (codone 61) del gene KRAS utilizzando un input di DNA di 100 ng. Il test può rilevare 19 mutazioni KRAS. La presenza di mutazioni viene rilevata con una specificità analitica di almeno il 99% e un limite di rilevamento di almeno il 5% di livello mutante in uno sfondo di DNA genomico di tipo selvaggio.
Il test di mutazione Cobas® KRAS si basa su due processi principali: (1) preparazione manuale del campione per ottenere DNA genomico da una o due sezioni spesse 5 µm di tessuto CRC FFPE contenenti almeno il 10% di cellule tumorali; (2) amplificazione PCR del DNA bersaglio mediante coppie di primer complementari e due sonde oligonucleotidiche etichettate con colorante fluorescente. Le coppie di primer utilizzate definiscono una sequenza di 85 coppie di basi per l’esone 2 contenente i codoni KRAS 12 e 13 e una sequenza di 75 coppie di basi per l’esone 3 contenente il codone KRAS 61 nel DNA genomico umano. Una sonda è progettata per rilevare la sequenza del codone KRAS 12/13 nell’esone 2 e l’altra sonda è progettata per rilevare la sequenza del codone KRAS 61 nell’esone 3 del gene KRAS. Il rilevamento delle mutazioni è ottenuto mediante l’analisi della curva di fusione da parte dell’analizzatore Cobas z 480 (1).
2. KRAS Mutation Test v2 (LSR)
Il KRAS Mutation Test v2 (LSR) è un test PCR allele-specifico, in tempo reale, per la rilevazione qualitativa e l’identificazione di esoni 2, 3 e 4 mutazioni nel gene V-Ki-ras2 Kirsten Rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) da formalina-fisso, paraffina-embedded tissue (FFPET). Il test è progettato per rilevare 28 mutazioni uniche. La presenza di mutazioni viene rilevata con una specificità analitica di almeno il 99% e un limite di rilevazione di almeno l ‘ 1% di livello mutante in uno sfondo di DNA genomico di tipo selvaggio.
Il test di mutazione KRAS v2 (LSR) si basa su due processi: (1) preparazione manuale del campione per ottenere DNA genomico da FFPET; e (2) amplificazione PCR e rilevamento del DNA bersaglio utilizzando coppie di primer complementari e sonde oligonucleotidiche etichettate con coloranti fluorescenti.
Il test di mutazione KRAS v2 (LSR) utilizza primer che definiscono specifiche sequenze di coppie di basi per ciascuna delle mutazioni mirate. L’amplificazione avviene solo nelle regioni del gene KRAS tra i primer; l’intero gene non è amplificato. Le sequenze KRAS mirate vanno da 79 a 114 coppie di basi. Il rilevamento delle mutazioni è ottenuto attraverso l’analisi PCR con l’analizzatore Cobas z 480. (1)
3. Test di mutazione BRAF/NRAS (LSR)
Il test di mutazione BRAF/NRAS (LSR) è un test PCR allele-specifico, in tempo reale, per la rilevazione qualitativa e l’identificazione delle mutazioni dell’esone 11 e 15 nel gene del proto-oncogene B-Raf (BRAF) e delle mutazioni dell’esone 2, 3 e 4 nel gene del neuroblastoma RAS viral oncogene homolog (NRAS).
Il test è progettato per rilevare 36 mutazioni uniche. La presenza di mutazioni viene rilevata con una specificità analitica di almeno il 99% e un limite di rilevamento di almeno il 5% di livello mutante in uno sfondo di DNA genomico di tipo selvaggio.
Il test di mutazione BRAF/NRAS (LSR) si basa su due processi principali: (1) preparazione manuale del campione per ottenere DNA genomico da FFPET; e (2) amplificazione PCR e rilevamento del DNA bersaglio utilizzando coppie di primer complementari e sonde oligonucleotidiche etichettate con coloranti fluorescenti.
Il test di mutazione BRAF/NRAS (LSR) utilizza primer che definiscono sequenze specifiche di coppie di basi per ciascuna delle mutazioni mirate. L’amplificazione avviene solo nelle regioni dei geni BRAF o NRAS tra i primer; l’intero gene non viene amplificato. Le sequenze BRAF vanno da 101 a 120 coppie di basi. Le sequenze delle ANR vanno da 94 a 121 coppie di basi. Il rilevamento delle mutazioni è ottenuto attraverso l’analisi PCR con l’analizzatore Cobas z 480. (2)
Implicazione clinica
KRAS e ANR sono membri della famiglia di oncogeni RAS strettamente correlati e le mutazioni in entrambi i geni a codoni 12, 13 (esone 2), codone 61 (esone 3) e codone 146 (esone 4) determinano un aumento dei livelli di proteine RAS legate alla guanosina trifosfato. La segnalazione iperattiva di RAS promuove l’oncogenesi. Nel carcinoma colorettale (CRC), le mutazioni di KRAS e NRAS a questi codoni si trovano fino al 50% dei casi e predicono una mancanza di risposta alla terapia anti-EGFR. La maggior parte delle mutazioni RAS sono mutazioni puntiformi che si verificano nell’esone 2 di KRAS (codoni 12 o 13; circa il 40%). Altre mutazioni RAS sono meno frequenti con le mutazioni più comuni che si verificano negli esoni KRAS 3 e 4 e negli esoni NRAS 2 e 3 (3).
Circa il 50% dei melanomi porta mutazioni attivanti in BRAF. Oltre il 90% delle mutazioni BRAF provoca un nucleotide 1799 T>Un cambiamento che porta a una sostituzione dell’acido valina-glutammico alla posizione 600 (V600E). La mutazione BRAF V600E causa una segnalazione incontrollata della via MAPK che porta a un’eccessiva crescita e proliferazione cellulare. Gli agenti che prendono di mira il BRAF mutante attivato (BRAF-inibitori) hanno dimostrato di avere successo nei pazienti con melanoma metastatico che ospita questa mutazione (1-3).
Oltre al suo valore predittivo nel melanoma, la mutazione BRAF V600E ha anche valore prognostico nel cancro del colon-retto e nel cancro del polmone (NSCLC) (4,5,7). La mutazione BRAF V600E si trova in circa il 10% del carcinoma colorettale metastatico ed è stata associata alla presenza di instabilità microsatellite (6). Nel complesso, i pazienti con CRC mutante BRAF hanno bassi tassi di risposta alle terapie convenzionali e prognosi sfavorevole. Mentre i melanomi mutati da BRAF V600 sono sensibili agli inibitori di BRAF, i CRC mutati da BRAF V600 potrebbero non essere altrettanto sensibili. L’attivazione di EGFR nel cancro del colon-retto potrebbe spiegare perché i tumori del colon-retto hanno generalmente una risposta inferiore agli inibitori di BRAF. Pertanto, si consiglia di iniziare una terapia di associazione con inibitori di EGFR e BRAF.
La mutazione BRAF V600E si trova anche nel 3-5% di tutti i tumori polmonari (7). Mentre BRAF-inibitori hanno dimostrato di avere successo nel mutazione V600E positivi pazienti con NSCLC, la FDA ha approvato l’uso della terapia di combinazione con BRAF e MEK inibitore per i pazienti con NSCLC con una mutazione V600E sulla base dei risultati di un’organizzazione internazionale, multicentrico, tre coorte non randomizzati, camere non-comparativo, open-label, trial in pazienti con localmente confermato mutazione V600E di BRAF-positivo NSCLC metastatico.
Requisiti del campione
I campioni accettabili per il test sono campioni di tessuto di carcinoma colorettale fissati in formalina e incorporati in paraffina con un tempo di fissazione di 6-48 ore.
Volume
Si preferisce 1 blocco di paraffina rappresentativo. In alternativa, per i campioni di resezione è richiesto un minimo di 5 sezioni di tessuto non colorate (spessore 5 µm) (test RAS completo).
Istruzioni per lo stoccaggio e la spedizione
Mantenere e spedire i campioni a temperatura ambiente.
Limitazioni
Il contenuto tumorale insufficiente potrebbe non consentire la rilevazione di mutazioni KRAS/NRAS/BRAF: è richiesto il 10% delle cellule tumorali. Il contenuto tumorale viene valutato prima dell’analisi e viene eseguita la macrodissezione. I fissativi diversi dalla formalina o il tempo di fissazione prolungato possono dare luogo a risultati inadeguati.
Requisiti speciali
Nessuno.
Turn-around-time
da 5 a 7 giorni lavorativi rispettivamente per vetrini e blocchi di paraffina.
- Li et al. Un test altamente verificato per il rilevamento delle mutazioni KRAS nel tessuto e nel plasma del cancro del polmone, del colon-retto e del pancreas. Arch Pathol Lab Med. 2019 Febbraio;143:183-9
- Patten et al. Un test sensibile e preciso per il rilevamento simultaneo di 36 mutazioni BRAF e NRAS. Rivista di Oncologia Clinica 2018 36:15
- Douillard JY et al. Trattamento Panitumumab-FOLFOX4 e mutazioni RAS nel cancro del colon-retto. N Ingl J Med. 2013 Settembre 12;369 (11): 1023-34.
Aggiornato il 03 Dicembre 2019
