Abstract
John Gurdon è un leader di gruppo distinto nel Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute e professore emerito nel Dipartimento di Zoologia presso l’Università di Cambridge. Nel 2012, ha ricevuto il premio Nobel in Fisiologia o Medicina insieme a Shinya Yamanaka per il lavoro sulla riprogrammazione delle cellule mature alla pluripotenza, e il suo laboratorio continua a indagare i meccanismi molecolari della riprogrammazione nucleare da parte di ovociti e uova. Abbiamo incontrato John nel suo ufficio di Cambridge per discutere la sua carriera e ascoltare i suoi pensieri sul passato, presente e futuro della riprogrammazione.
Il tuo primo articolo fu pubblicato nel 1954 e non riguardava l’embriologia ma l’entomologia. Com’e ‘ successo?
Bene, quel primo articolo fu pubblicato sulla rivista mensile dell’Entomologo. Durante i miei primi anni di vita, ero davvero interessato agli insetti e collezionavo farfalle e falene. Quando ero uno studente mi piaceva prendere tempo libero e andare a Wytham Woods vicino a Oxford per vedere cosa riuscivo a trovare. Così sono uscito un freddo giorno di primavera e non c’erano farfalle, né falene, ma, dal nulla, c’era una mosca-l’ho presa, l’ho messa nella mia bottiglia e l’ho guardata. La prima cosa che era evidente era che non era una mosca, era un imenottero, ma quando ho cercato di identificarlo semplicemente non riuscivo a capire cosa fosse. Non mi piace essere sconfitto, quindi sono andato al Dipartimento Hope di Oxford e non sapevano nemmeno cosa fosse, e poi al Museo di Storia Naturale, dove un curatore mi ha detto che, sorprendentemente, questa era una specie mai registrata in Inghilterra prima! Questo era intensamente irritante per il Dipartimento di Entomologia di Oxford, perché il professore al momento aveva un importante studio ecologico di tutti gli insetti in quei boschi, e qui era uno studente che aveva appena catturato la prima cosa che riusciva a trovare, e raccolse una nuova specie. Così ho scritto un paio di paragrafi che annunciavano la scoperta, ed è così che sono arrivato ad avere quel documento.
E hai mantenuto il tuo interesse per gli insetti?
Non proprio in un modo scientifico corretto, anche se continuo a pensare che mi piacerebbe tornare a quello, principalmente perché i modelli di colore dei lepidotteri sono così notevoli. Non sappiamo quasi nulla di come si formano i modelli di colore – in qualsiasi specie. Non avrai un gene che mette un punto su un’ala, è un processo più complicato, inclusa la diffusione di molecole. Continuo a pensare che quando andrò in pensione lo prenderò, ma devo ancora arrivare a quel punto!
Mezzo secolo fa hai iniziato i tuoi esperimenti di trasferimento nucleare, e oggi il tuo laboratorio sta ancora pubblicando su di esso. Perché pensi che un esperimento così concettualmente semplice abbia avuto una durata di conservazione così lunga?
Quando stavo facendo quei primi esperimenti di trasferimento nucleare – e sono permanentemente grato al mio supervisore, Michael Fischberg, per avermi messo su quel lavoro – la domanda al momento era se tutte le cellule del corpo hanno gli stessi geni. Un modo per determinare questo era prendere un nucleo da un tipo di cellula, metterlo nell’uovo e vedere se può svilupparsi. Questo esperimento è stato concepito nel lontano 19 ° secolo: c’è un documento di un uomo di nome Rauber che descrive un esperimento di mettere un nucleo di rospo in un uovo di rana, e dice semplicemente che non ha ottenuto un risultato, quindi non è chiaro se ha fatto l’esperimento o no!
Comunque, nel 1950 Briggs e King, due americani, hanno sviluppato la tecnica del trapianto del nucleo, e Fischberg ha deciso che dovremmo provare questo in Xenopus. Ci sono state diverse difficoltà tecniche molto fastidiose che alla fine abbiamo superato – tanto per fortuna quanto per abilità – e il risultato finale è stato che è possibile ottenere uno sviluppo essenzialmente normale prendendo il nucleo di una cellula specializzata, in questo caso una cellula intestinale, e trapiantandola in un uovo enucleato. Ciò ha detto chiaramente che gli stessi geni sono presenti in tutti i diversi tipi di cellule.
E poi c’era questo divario di 50 anni prima che Yamanaka sviluppasse la tecnica delle cellule staminali pluripotenti indotte, che apriva davvero il campo a un potenziale clinico utile. Gli esperimenti rana (e molto lavoro successivo, tra cui la generazione di Dolly the sheep nel 1990) ha detto che è possibile invertire o ringiovanire un nucleo specializzato di nuovo all’inizio di nuovo, ma la traduzione clinica è diventata una possibilità realistica negli esseri umani solo quando Yamanaka ha mostrato che non aveva bisogno di ottenere uova umane o embrioni per L’idea che si potessero ricavare nuove cellule di un tipo a partire da cellule adulte di un tipo completamente diverso, ovviamente, ha suonato con il nostro lavoro da mezzo secolo prima, ma, abbastanza interessante, questo non era assolutamente evidente quando questi primi esperimenti furono fatti. La riprogrammazione non era nemmeno lo scopo degli esperimenti. Immagino che non otterrei supporto per portare avanti questi esperimenti di trasferimento nucleare oggi se non fosse per la loro rilevanza per la riprogrammazione negli esseri umani.
Quindi la domanda è come funziona questo processo? Cosa sta alla base della capacità dell’uovo di ringiovanire un nucleo? Siamo sempre stati interessati a questa domanda, ma è diventato sempre più interessante con gli esperimenti di Yamanaka. E vorrei sottolineare che le persone ancora non sanno davvero perché la procedura Yamanaka funziona – anche dopo dieci anni, non capiscono davvero il meccanismo. Quindi consideriamo, ed è vero, che l’uovo fa un lavoro piuttosto migliore di invertire la differenziazione rispetto ai fattori di trascrizione sovraesprimenti, e quindi pensiamo che se sapessi quali sono tutti i componenti dell’uovo e sapessi come farli scambiare con quelli somatici, non avresti bisogno dei fattori Yamanaka. Questo è il motivo per cui stiamo attivamente perseguendo il meccanismo di riprogrammazione da parte dell’uovo, utilizzando la stessa procedura che è stata fatta 60 anni fa, ma con un sacco di nuovi modi di indagare su di esso. Per me, questo esemplifica il principio interessante che il lavoro che è stato fatto in una sola volta può avere una rilevanza successiva, molto maggiore alla luce dei progressi successivi.
Stiamo attivamente perseguendo il meccanismo di riprogrammazione da parte dell’uovo, usando la stessa procedura che è stata fatta 60 anni fa, ma con un sacco di nuovi modi di investigarlo
E qual è la tua attuale comprensione dei meccanismi molecolari di riprogrammazione da parte dell’uovo?
È quasi certamente dovuto ad un’alta concentrazione nell’uovo di componenti della cromatina, in particolare gli istoni. Ci sono numerose varianti di istoni, in termini di come vengono modificati, e un bel po ‘ del nostro recente lavoro ha descritto i cambiamenti di istoni che sono imposti dall’uovo su un nucleo in arrivo. Questo cambiamento della cromatina è forse il primo stadio chiave-c’è una particolare variante dell’istone presente nelle uova che è molto importante, ed è probabile che la sostituzione dei componenti adulti della cromatina con quelli presenti nell’uovo sia in definitiva ciò che aiuta a causare il cambiamento.
Ci sono due aspetti di questo problema. Uno è come l’uovo usa i suoi componenti per sostituire quelli del nucleo somatico e quindi ringiovanirlo? Il secondo è perché la riprogrammazione non funziona perfettamente? Mi piace illustrarlo in questo modo: c’è una battaglia tra l’uovo, che cerca di trasformare tutto in uno stato embrionale, e il nucleo somatico, che è progettato per essere esattamente l’opposto – è destinato a non cambiare. La maggior parte delle nostre cellule non cambia, ed è molto importante che le cellule siano straordinariamente stabili. Quindi l’uovo cerca di scavalcare il nucleo e il nucleo cerca di resistergli; queste sono le due parti complementari del nostro progetto di ricerca al momento.
Per completare questo, stiamo anche osservando i cambiamenti che si verificano in un nucleo spermatico che lo rendono così straordinariamente ricettivo alla riprogrammazione; in definitiva, vorremmo convertire il nucleo somatico nella stessa condizione dello sperma, e quindi la riprogrammazione dovrebbe funzionare molto bene.
Mentre penso che la maggior parte dei lettori avrà familiarità con i tuoi esperimenti di riprogrammazione, mi piacerebbe discutere di alcuni dei tuoi altri lavori. In una serie di articoli negli anni 70 hai studiato la traduzione dell’RNA iniettato negli ovociti di rana: puoi parlarci un po ‘ di questo lavoro?
L’esperimento che mi ha attratto enormemente all’epoca, e lo fa ancora, è quello di iniettare RNA messaggero (mRNA) nelle uova. Stavo facendo questo lavoro quando le persone, in particolare Hubert Chantrenne in Belgio, avevano isolato per la prima volta l’mRNA. Ero un buon amico di un uomo meraviglioso di nome Jean Brachet, e gli ho detto che quello che mi piacerebbe davvero fare è trapiantare non nuclei ma mRNA in uova. Mi ha dato un’introduzione a Chantrenne, che stava facendo coniglio globina RNA e ci ha dato un po’, grazie a Brachet. La roba era noto per essere estremamente sensibile RNase, così si doveva quasi fare un bagno in acido cromico prima di toccare nulla! Ora, se avessi proposto quell’esperimento come sovvenzione, sarebbe stato respinto perché l’uovo era noto per essere pieno di ribonucleasi: mettere mRNA sensibile in un ambiente ribonucleico non avrebbe senso. Tuttavia, ha funzionato, e sorprendentemente bene – il messaggio della globina è andato in uova, e quando le uova si erano trasformate in girini c’era ancora la globina di coniglio in fase di produzione. Quasi certamente la ragione del successo è che la microiniezione non apre i lisosomi, dove le ribonucleasi sono partizionate. Quindi c’è un altro principio interessante: quando qualcuno ti dice che qualcosa non funziona, è molto meglio provarlo che credergli sulla parola. E l’iniezione di mRNA si è rivelata un approccio molto utile per tutti i tipi di domande. Questi esperimenti di RNA erano davvero un derivato dei risultati tecnologici del trasferimento nucleare – se funziona per i nuclei, cos’altro puoi trasferire? Eddy de Robertis ed io avevamo anche un giornale che chiamava l’uovo di Xenopus una provetta vivente.
Eri anche interessato al processo di induzione e hai identificato un “effetto comunitario” nell’induzione del mesoderma Xenopus. Qual è la base di questo effetto?
Per molti decenni le persone avevano trapiantato tessuto – prendere un pezzo di tessuto e innestarlo su un altro ospite. Ma il tessuto è ovviamente composto da molte cellule, che potrebbero non essere tutte uguali, e per me è sempre stato desiderabile fare un trapianto monocellulare. E così ho fatto un sacco di quelli, spostando singole cellule progenitrici da una parte all’altra dell’embrione, ma non sono mai riuscito a farlo funzionare – le cellule morivano sempre. Ci deve essere stato qualche motivo per cui è possibile trapiantare con successo più cellule, ma non singole cellule. Questo mi ha portato a eseguire iniezioni di un numero sempre più piccolo di cellule. Si è scoperto che le cellule trapiantate rilasciano molecole secrete-proteine di segnalazione per esempio-che sono necessarie per loro di fare qualsiasi cosa nell’ospite. Una singola cellula ha difficoltà a fare molto con ciò che secerne – la concentrazione è troppo bassa-ma più cellule costruiranno una concentrazione abbastanza alta per funzionare effettivamente. Questo “effetto comunitario” è in qualche modo analogo al quorum sensing identificato nei batteri.
Qual è il tuo punto di vista su dove la biologia dello sviluppo come un campo è oggi? Quali sono le lacune nella nostra comprensione, e cosa dobbiamo fare per colmare le lacune?
La mia visione dello sviluppo è che si deve cercare di restringere le cose a singole entità, che si tratti di una cellula o di un nucleo o di una molecola, e sono spesso ridicolizzato perché chiedo sempre alle persone a quale concentrazione si trova la loro molecola, e diranno che non importa.
Direi che la concentrazione e il tempo sono le due cose critiche nello sviluppo. Devi conoscere la concentrazione e devi sapere quanto tempo deve essere lì per fare la differenza-perché per le cellule, una particolare concentrazione di una molecola per alcuni secondi potrebbe non essere la stessa di quella concentrazione per 10 minuti. Quindi ritengo che ciò che ci manca veramente nella biologia dello sviluppo al momento sia qualsiasi capacità di determinare la concentrazione di proteine, analoga alla misurazione degli acidi nucleici usando la PCR.
Nella mia esperienza personale, sono stato coinvolto in esperimenti su una proteina chiamata Activin, una molecola TGF-β. Piuttosto sorprendentemente-e mi piace ancora questo esperimento-puoi prendere le cellule della blastula, dissociarle completamente in sospensione e quindi aggiungere Activin a una concentrazione nota per un tempo noto. Quindi lavi le cellule e lasciale reaggregare e chiedi come si differenziano. Si è scoperto che il risultato – se queste cellule hanno fatto ectoderma, mesoderma o endoderma – dipendeva non solo dalla quantità di Activin ma anche dal tempo in cui si bagnavano le cellule in esso. Era un principio interessante che la concentrazione e il tempo possono avere effetti completamente diversi a seconda di quale si altera e di quanto.
Ma per capire davvero fenomeni sorprendenti come questo in vivo, conoscere la concentrazione di proteine sarà davvero importante, e penso che al momento ci manchi completamente. In futuro lavoreremo gradualmente con singole cellule, concentrazioni note, quantità note di tempo, e poi potremo arrivare a capire cosa sta succedendo in questi eventi di differenziazione.
Concentrazione e tempo sono le due cose critiche nello sviluppo
Il tuo lavoro sarà probabilmente più clinicamente influente nel campo della sostituzione cellulare – cosa ne pensi delle sfide e delle prospettive attuali?
Penso che le prospettive per la sostituzione delle cellule siano molto buone, ma il progresso scientifico potrebbe essere ostacolato da altre cose. L’esempio che uso spesso è la degenerazione maculare legata all’età, dove i fotorecettori muoiono e così si diventa ciechi. Questi fotorecettori sono supportati da cellule epiteliali pigmentate retiniche e ricercatori a Londra e altrove possono utilizzare la procedura Yamanaka per creare strati sottili delle cellule epiteliali e quindi inserirle nell’occhio con un processo che non è più complicato della sostituzione delle lenti. Ogni volta che parlo di questo, la gente viene da me e chiede quando possono farlo. La risposta è che non sono autorizzati a, e la ragione a mio parere risale in ultima analisi, alle questioni legali. Se qualcosa va storto, gli avvocati si batteranno per enormi quantità di risarcimento. Se fai la procedura cento volte, e va male una volta-novantanove persone guadagneranno tremendamente nel non diventare ciechi, ma si otterrà un premio finanziario così massiccio che la professione medica si allontanerà da esso. Penso che questa sia una vera sfida sul campo-la resistenza della professione medica a causa delle potenziali conseguenze legali e finanziarie.
Hai già parlato dell’importanza della guida il tuo supervisore di dottorato, Michael Fischberg, e molti dei tuoi mentee hanno parlato di te come di un grande mentore. Qual è lo stile di leadership Gurdon?
Bene, sarei molto autocritico qui-non mi siedo con tutti per un’ora alla settimana per esaminare i loro risultati, aspetto solo di vederli davanti a un caffè e chiedo come stanno andando le cose. Quindi devo essere un mentore terribilmente cattivo nel senso di non fare davvero un controllo regolare e metodico delle cose. Ma mi piace pensare che la gente otterrà qualcosa solo dalla conversazione ordinaria. Qualcuno come Doug Melton era un collega davvero fantastico, ma questo è stato tutto attraverso la sua capacità – Non riesco a pensare a quello che ha ottenuto da me! Cerco semplicemente di convincere le persone che vengono nel mio laboratorio a lavorare su un progetto utile, e poi lasciarli godere.
Dovrei solo commentare che Michael Fischberg è stato davvero un mentore straordinario e generoso. Mi ha messo a questo lavoro di trasferimento nucleare, dicendomi che avrei dovuto provare tutto quello che volevo, ed è stato estremamente favorevole. Il primo documento sul trasferimento nucleare-non ha fatto gli esperimenti, ma è stato un autore su di esso, e giustamente. Ma dopo, quasi con mio imbarazzo, ha detto ‘tu prendi le cellule dell’endoderma, io prenderò il resto’. E quindi non era un autore sugli altri giornali – è stato straordinariamente generoso, davvero.
Avevo programmato di chiedere se sei ancora connesso al banco di laboratorio, ma ho ricevuto la mia risposta quando sono arrivato nel tuo ufficio oggi mentre stavi cambiando i media per un lotto di uova Xenopus. È importante per te mantenere questa connessione?
Ho sempre mantenuto il mio lavoro di laboratorio, anche quando facevo anche altre cose, e insegno ancora il trasferimento nucleare ai miei colleghi. Questo collegamento con la panchina ovviamente non è realistico per tutti, ma mi piace pensare che facendolo a volte si scoprono cose che potrebbero non essere ovvie. Non ha senso usare macchine PCR o quel genere di cose, e uno dei miei colleghi al momento sta eseguendo un western blot per me. Ma il lavoro di laboratorio che sto facendo ora dipende più dal cercare di trovare modi per far sì che queste cellule facciano ciò che voglio che facciano – e questo è qualcosa che conosco bene.
Il Premio Nobel ha cambiato sensibilmente la tua vita?
Beh sì, nel senso che ottengo una quantità ridicola di inviti, che è in esecuzione ora a circa 200 all’anno. Non puoi iniziare a gestirlo – viaggio meno di prima, e sono piuttosto selettivo su ciò che accetto. Ricevo un sacco di inviti non per il mio contributo scientifico, ma piuttosto per il mio rapporto scolastico, in cui il mio maestro di biologia ha scritto che non avrei alcuna possibilità di successo come scienziato, e che è incorniciato sopra la mia scrivania. Quella storia ovviamente ha fatto una grande impressione troppo.
C’è anche il riconoscimento del pubblico. Molto presto dopo il premio Nobel è stato reso noto mi è capitato di essere in Corea del Sud. Camminando lungo la strada, qualcuno mi ha fermato e mi ha chiesto se ero il dottor Gurdon, e mi ha detto la mia fotografia era sul giornale. E ‘ stato davvero notevole, la copertura che il premio ha ottenuto. Ovviamente è anche bello per le persone apprezzare il mio lavoro, e quello di Yamanaka, e che la gente stesse parlando di riprogrammazione.
C’è qualcosa che i lettori di sviluppo sarebbero sorpresi di scoprire su di te?
Ritengo che sia importante mantenersi ragionevolmente in forma e in buona salute. Ho sempre mantenuto un interesse in varie attività sportive, in particolare sci, pattinaggio e squash, che erano le mie attività principali, anche se mi sono rivolto negli ultimi anni al tennis da squash.
Ma suppongo che ciò che potrebbe sorprendere i lettori è che io sono un completo non intellettuale. E ‘ solo che non leggo libri, odio leggere e non vado neanche a teatro. Se mi viene chiesto perché non mi piace leggere, dirò che ci vuole molto tempo, è molto più facile parlare con qualcuno che ha letto il libro e chiedere la linea di fondo! Non sono interessato alla finzione, non è solo per me. Quindi sono davvero l’ultimo non intellettuale.
