ノッキングダウンおよびノッキングアウト遺伝子

遺伝子ノッキングダウン
この技術は、一つ以上の生物の発現を減少させることを可能にする。 これは、遺伝子改変を介して、または遺伝子またはmRNA転写物のいずれかに相補的な配列を有する短いDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドのようなareagentで処
遺伝子発現の変化がmRNAとのオリゴヌクレオチド結合または遺伝子への一時的な結合によって引き起こされる場合、これは染色体DNAを改変しない遺伝子発現の一時的な変化をもたらし、その結果を”一過性ノックダウン”と呼ぶ。
一過性のノックダウンでは、このオリゴヌクレオチドの活性遺伝子またはその転写産物への結合は、発現の低下を引き起こす。 結合は、転写の遮断、mRNA転写物の分解（例えば、mRNA転写物の分解）を介して起こり得る。 siRNAまたはRNase-H依存性アンチセンス）、またはmirnaを含む他の機能性Rnaの成熟に使用されるmRNA翻訳、プレmRNAスプライシング部位、またはヌクレアーゼ切断部位のブロッe.g.by モルフォリーノオリゴ）。
一過性のノックダウンの最も直接的な使用は、配列決定されているが、未知の機能を有する遺伝子についての学習のためである。 この実験は逆遺伝学として知られている。 オリゴは単細胞接合体に注入することができ、注入された細胞の娘細胞に存在するので、一時的なノックダウンはしばしば発生生物学で使用される。＜5940＞＜8913＞ＲＮＡ干渉（Ｒｎａｉ）は、ｍＲＮＡ分解を介して遺伝子をサイレンシングする手段である。 遺伝子ノックダウンこの方法は、小さな二本鎖干渉RNA（siRNA）を細胞質に導入することによって達成される。 一旦細胞に導入されると、外因性ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣによって処理される。 ＳｉＲＮＡは、サイレンシングされる標的ｍ ＲＮＡに相補的であり、ＲＩＳＣは、標的ｍ ＲＮＡを特定するための鋳型としてｓｉＲＮＡを使用する。 ＲＩＳＣが標的ｍ ＲＮＡに局在化した後、ＲＮＡはリボヌクレアーゼによって切断される。
RNAiは、遺伝子機能解析に使用されます。 Ｒｎａｉの使用は、潜在的な治療標的、薬物開発、または他の適用を同定するのに有用であり得る。

遺伝子ノックアウト
遺伝子ノックアウト（KO）は、生物の遺伝子の一つが動作不能である遺伝的技術です。 ノックアウト生物は、通常、遺伝子機能を研究するために使用されます遺伝子損失の影響を調査することによって。 ヘテロ接合およびホモ接合Kos：前者では、一つの対立遺伝子のみがノックアウトされ、後者では二つの対立遺伝子の両方がノックアウトされる。

KOの指向的な作成は、プラスミド、細菌の人工染色体または他のDNA構築物を用いて試験管内で開始し、細胞培養に進む。 細胞をＤｎａｃｏｎｓｔｒｕｃｔで形質移入する。 多くの場合、目標は、変異した遺伝子を有するトランスジェニック動物を作成することである。
そうであれば、胚性幹細胞は遺伝的に形質転換され、初期胚に挿入される。 彼らの生殖系列細胞の遺伝的変化を伴う結果として生じる動物は、その後、しばしば遺伝子ノックアウトをfuturegenerationsに渡すことができる。

constructisは、遺伝子自体からの配列を構築物に組み込むことによって行われる標的遺伝子と組換えするように設計された。組換えは、次いで、遺伝子内のその配列の領域で起こり、その結果、遺伝子を破壊するための外来配列の挿入をもたらす。
条件付きノックアウトは、組織または時間特異的な方法で遺伝子の欠失を可能にする。 これは、遺伝子の周囲にｌｏｘＰ部位を導入することによって行われる。 これらのシーケンスは、aknock-outと同じメカニズムを介して生殖系列に導入されます。 この生殖系列は、これらの配列を認識し、それらを組換え、これらの部位に隣接する遺伝子を削除することができるウイルス酵素である別の生殖系列を含むCre-recombinaseに交差させることができる。
dna組換えはまれな事象であるため、挿入のために選択された外来配列には通常、レポーターが含まれる。 これはノックアウトが巧妙だった個人か容易な選択のofcellsを可能にする。 時には、DNAconstructは、所望の相同性なしに染色体に挿入する標的遺伝子との結合。＜5940＞＜8913＞（Ivana Venezia）＜5940＞＜8913＞ノックダウン＜6511＞遺伝子の発現を低下させる技術である。 この還元は、DNA修飾またはmRNAまたは遺伝子のいずれかに結合するオリゴヌクレオチドに起因する可能性がある。 この場合、表現の変化は一時的なものなので、一時的なノックダウンについて話してください。
遺伝子の一時的なノックダウンを可能にする技術の一つは、モルホリノオリゴマーの使用で構成されています。 それらは動物の胚系における標準的なノックダウンツールとなっているため、Morpholinooligosは胚における特定のmRNA転写産物の役割を調査するためによく使用される。 その分子構造は、ホスホロジアミダート基を介して連結されたメチレンモルホリン環の骨格に結合したDNA塩基を有する。 Morpholinosは、リボ核酸（RNA）の塩基対形成surfacesofの小さな（-25塩基）特定の配列へのothermoleculesのアクセスをブロックします。 それらの完全に不自然な骨格のために、モルフォリノは細胞タンパク質によって認識されない。 ヌクレアーゼはモルフォリノを分解せず、血清中や細胞中でも分解されない。 モルフォリノがtoll様受容体を活性化したり、インターフェロン誘導やNF-κ bを介した炎症応答などの自然免疫応答を活性化したりする報告はない。モルフォリノはDNAメチル化を改変することは知られていない。
モルフォリノは、多くのアンチセンス構造型（例えば、ホスホロチオエート、siRNA）とは異なり、標的RNA分子の分解を誘発しない。 その代わりに、モルホリノサクトは、”立体遮断”により、RNA内の標的配列に結合し、そうでなければRNAと相互作用する可能性のある分子を阻害する。
Morpholinosはまたpre-mRNAのスプライシングを変更したり、miRNAのthematurationそして活動を禁じることができます。
Blocking Translation
メッセンジャー RNA(mRNA)の5′-untranslatedregionに結合し、モルフォリンは5’キャップからスタートコドンへのリボソーム開始複合体の伸長を妨げる可能性がある。 これにより、標的転写物のコード領域の翻訳（”ノックダウン”geneexpressionと呼ばれる）が防止される。 モルフォリノは、タンパク質の発現をノックダウンし、ノックダウンが細胞または生物をどのように変化させるかを学ぶaconvenient手段を提供する。
修飾pre-mRNAスプライシング
Morpholinoscanは、pre-mRNAのストランド上のイントロンの境界で標的に結合することから、または求核性アデニン塩基を遮断してスプライス構造を形成するのを防ぐことによって、またはスプライス調節タンパク質の結合を妨害することによって、プレmRNA処理ステップを妨害する。 SnRNP U1（ドナー部位）またはu2/U5（ポリピリミジン部分とアクセプター部位）の結合を防止することは、一般的にmrnaからエクソンを除外し、スプライシングを いくつかのスプライスターゲットを標的とするとイントロン介在物が生じるが、不可解なスプライスサイトの活性化は部分的な介在物または排除につながる可能性がある。U11/U12snRNPsのターゲットもブロックすることができます。 スプライス修飾は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）によって簡便にアッセイでき，ＲＴ-ＰＣＲ産物のゲル電気泳動後のバンドシフトと見られる。
ノックアウト
伝統的な遺伝子ノックアウトのバリエーションは、条件付き遺伝子ノックアウトです。
条件遺伝子ノックアウトは、肝臓などの特定の組織における特異的遺伝子を排除するために使用される技術である。 この技術は有用です生きている生物における個々の遺伝子の役割を研究する。 それは生命の始めから削除されるより特定のtimesratherで特定の遺伝子を目標とするのでfromtraditionalの遺伝子のノックアウト異なります。 条件付きgeneknockoutの技術を使用して従来の遺伝子のノックアウトから副作用の多数を除去します。 伝統的な遺伝子ノックアウトでは、遺伝子変異による胚死が起こる可能性があり、これは科学者が遺伝子を研究することを妨げる。 いくつかの組織は単独で適切に研究することができないので、遺伝子は特定の組織では不活性であり、他の組織では活性を維持しなければならない。 この技術では、科学者は特定の段階で遺伝子をノックアウトすることができますある組織の遺伝子のノックアウトが他の組織の遺伝子にどのよ
最も一般的に使用される手法は、Cre-loxrecombinationシステムです。 Creリコンビナーゼ酵素は、DNA内の二つのlox（組換え遺伝子座）部位を特異的に認識し、それらの間に組換えを引き起こす。 この組換えは、それらの向きに応じて、2つのlox部位間の遺伝子の欠失または反転を引き起こす。 Anentire遺伝子を除去または不活性化することができる。 この全システムは誘導可能です従ってachemicalは特定の時に遺伝子をノックアウトするために加えることができます。 最も一般的に使用される化学物質の二つは、核へのクレコンビナーゼタンパク質の輸送を活性化するthecreリコンビナーゼ遺伝子とタモキシフェンの転写を活性化するテトラサイクリンである。 いくつかの細胞型のみがクレレコンビナーゼを発現し、哺乳類細胞はそれを発現しないので、哺乳類で条件付き遺伝子ノックアウトを使用する場合、lox部位の偶発的活性化の危険性はない。
Cre遺伝子を含むマウスとloxP配列を含むマウスを繁殖させ、目的の特定の遺伝子の条件付きノックアウトを生成する。 マウスは自然にCreリコンビナーゼまたはloxsitesを発現しないが、彼らは望ましい子孫を作成するために、これらの遺伝子産物を発現するように設計されて 重要なエクソンがフロックスされたマウス（aLox-P上流および下流を有することを意味する）と、細胞型特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターによって発現が調節されているCre配列を有するマウスを得る必要がある。
(Francesca Luca)

RNA干渉メカニズム

rna干渉(RNAi)は、細胞の抗ウイルス応答であり、遺伝子発現をサイレンシングするための自然なメカニズムである。 それはanytarget遺伝子の機能の特定の阻止を可能にするのに開発することができます。 RNAiは病気プロセスにかかわるidentificationofの新しい遺伝子を非常に貴重な研究用具、それ援助であると証明しています。

rnaiは遺伝子発現の唯一のメカニズムではない（表1）。

表1:遺伝子サイレンシングのための異なる方法間の比較。

ＲＮＡ干渉（Ｒｎａ Ｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞への導入に応答して生じる。 DsRnaの導入はofdsRNA依存性蛋白質のキナーゼR(PKR)の活発化を誘発します。 活動化させたPKRはthetranslationの開始の要因EIF2をリン酸化します:この効果は、rnase-Lのactivationofおよびインターフェロンの生産の誘導と関連して、蛋白質の統合のandpromotes apoptosisを停止 全体的に、これは抗ウイルス防御機構を表すと考えられている。 RNAiis分類学的種全体で高度に保存されたメカニズム。 抗ウイルス活性を有することに加えて、RNAiはまた、挿入変異原として作用することによってゲノムを不安定にするトランスポゾンなどのゲノムの潜在的に有害なセグメントの発現を抑制すると考えられている。

そのメカニズムは完全には解明されていませんが、RNAiは多段階プロセスの結果を表しています（図1）。 細胞に入ると、長いdsRNAは最初にRNAse III酵素ダイサーによって処理される。 この機能的二量体は、ヘリカーゼ、dsRNA結合、およびPAZドメインを含む（それらの役割は完全に排除されていない）。 ダイサーは21-23ヌクレオチドdsRNA断片を生成し、二つのヌクレオチド3’末端オーバーハング、すなわちsirnaを生成する。 ＲＮＡｉは、ＳＩＲＮＡによって誘導され、ｓｉＲＮＡに相同な配列を含むｍＲＮＡを認識し、相同領域のほぼ中央に位置する部位でｍＲＮＡを切断するＲＮＡ−誘導シレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によ したがって、遺伝子発現は、転写後レベルで特異的に不活性化される。

elegans、Dicerはrdeタンパク質と相互作用する。 Ｒｄｅタンパク質は長いｄｓＲＮＡに結合し、長いｄｓＲＮＡを処理のためにダイサーに提示することが信じられている。 RNAiに対する高度の耐性を示す変異体は、atrde-1およびrde-4遺伝子座の変異を有することが報告されている。

図1:RNAinterferenceのメカニズム

（例えば、ウイルス感染の結果として）細胞内の二重鎖（ds）RNAの出現は、他の現象の中で（例えば、ウイルス感染の結果として）を含む複雑な応答を誘発する。インターフェロン産生とその結果）RNAiとして知られている分子事象のカスケード。 RNAiの間に、細胞酵素のダイサーはdsRNAに結合し、smallinterfering RNA(siRNA)として知られている長さが~20のヌクレオチドの組の短い部分にcleavesit。 これらのＲＮＡ対は、ｓｉＲＮＡの一本鎖を使用して相補配列の一本鎖ＲＮＡ分子（すなわちｍＲＮＡ）に結合するｒｎａ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる細胞酵素に結合す その後、RISCのヌクレアーゼ活性はmRNAを分解し、ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする。 同様に、細胞の遺伝的機構は、内因性mRNAの発現を制御するためにRNAiを利用すると考えられており、したがって、転写後調節の新しい層を追加する。 RNAiは、高特異性で比較的容易な技術で目的の標的遺伝子をノックダウンするために実験的な設定で利用することができる（詳細については、テキストを

genesilencing以外にも、RNAiは遺伝子調節の他の現象に関与している可能性があります。. RNAiは、より古典的にメチル化に関連するCpGsequencesだけでなく、シトシンをメチル化することによっても機能することができることがわかります。 標的配列がプロモーターと相同性を持つ場合、転写サイレンシングが起こる可能性がある。 さらに、RNAは最終的にDNAのメチル化を指示するクロマチンの範囲と相互に作用しているようである。 線虫C.elegansの研究は、rnaiはsiRNAにヒンジしないかもしれないメカニズムを介して細胞間に広がることができることを示している。全身RNA干渉欠損（sid）遺伝子座、sid-1は、sid-1タンパク質が長いdsRNA、siRNA、または現在発見されていないRNAi関連シグナルのチャネルとして作用することを示唆し、シグナルペプティッド配列と11推定膜貫通ドメインと保存タンパク質をコードしている。 Sid-1変異体retaincell自律RNAiが、RNAiの拡散を示すために失敗します。 Sid-1と予測されたヒトおよびマウスタンパク質との間に強い類似性が報告されているが、この全身RNAiが哺乳類で発生するかどうかは不明である。

（ジュスティーヌ小花）

ソース: https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

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ZFN,TALEN,CRIPR/CAS9

これらの三つの分子技術は、部位特異的な方法でゲノムを編集することを可能にし、それぞれの技術は異なるメカニズムを有する。 ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNs）と転写活性化剤のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）は、非特異的なDNA切断ドメインにリンクされたプログラム可能な、配列特 ZFNsとTALENsは、特定のゲノム位置でエラーが発生しやすい非相同末端結合または相同性指向の修復を刺激するDNA二本鎖切断を誘導することにより、遺伝的修飾の広い範囲を可能にする。

http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

から撮影した画像ZFNsとTALENsの汎用性は、DNA結合ドメインをカスタマイズして事実上任意の配列を認識できることから生じます。 これらのDNA結合モジュールは、ヌクレアーゼ、転写活性化因子およびリプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポーザー、DNAヒストンメチルトランスフェラーゼおよびヒストンアセチルトランスフェラーゼを含むゲノム構造および機能に影響を与えるために多数のエフェクタードメインと組み合わせることができる。 したがって、正常に遺伝的変化を実行する能力は、設計された亜鉛フィンガーとTALEタンパク質のDNA結合特異性と親和性に大きく依存します。

Cys2-His2亜鉛フィンガータンパク質

Cys2-His2亜鉛フィンガードメインは、真核生物に見られるDNA結合モチーフの最も一般的なタイプの一つであり、ヒトゲ 個々の亜鉛指は保存されたβ β α配置のおよそ30のアミノ酸から成っています。 Αヘリックスの表面上のいくつかのアミノ酸は、典型的には、選択性の様々なレベルで、DNAの主要な溝に三つの塩基対を接触させます。 亜鉛指蛋白質のモジュール構造はそれらに注文DNA結合蛋白質の設計のための魅力的なフレームワークをしました。 特定のDNA認識のための亜鉛指タンパク質のアプリケーションへの鍵は、三つ以上の亜鉛指ドメインを含む不自然なアレイの開発でした。 この進歩は、長さが9-18bpsのDNA配列を認識し、合成亜鉛指タンパク質の構築を可能にする高度に保存されたリンカー配列の構造ベースの発見によって促進 18bpsのDNA配列は68億bpのDNA内で特異性を与えることができるため、この方法により、特定の配列をヒトゲノム中で初めて標的とすることができた。

転写活性化剤様エフェクター

TALEsは、植物病原菌Xanthomonas属から天然に存在するタンパク質であり、それぞれが単一のbpを認識する一連の33-35アミノ酸リピートドメインからなるDNA結合ドメインを含む。 ＴＡＬＥ特異性は、反復可変ジレシデュー（Ｒｖｄ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。 Zinc-fingersと同様に、モジュラーテールリピートは連続したDNA配列を認識するために一緒にリンクされています。 しかし、ジンクフィンガータンパク質とは対照的に、理論的にはゲノム内の単一のサイトに対処する能力を持つ物語の長い配列を構築するために必要な繰り返し間のリンケージの再工学はありませんでした。 HDR（相同直接組換え）を促進する上での役割に加えて、サイト特異的ヌクレアーゼはまた、ヌル表現型を持つ細胞株や生物の迅速な生成を可能にします; ヌクレアーゼ誘導DSBのNHEJを介した修復は、フレームシフト変異を介して遺伝子機能のノックアウトで、その結果、標的部位で小さな挿入または欠失の導入

http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

から撮影した画像上記の部位特異的ヌクレアーゼとは異なり、CRISPR（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats）/CRISPR関連（Cas）システムは、標的遺伝子変化を誘導するためのZFNsおよびTALENsの潜在的に容易で効率的な代替として最近浮上している。 細菌では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を介して侵入する外来ＤＮＡに対する後天性免疫を提供する。 ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、「スペーサー」と呼ばれる外来ＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、転写され、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理される。 これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニールし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの直接配列特異的切断およびサイレンシングを行う。 最近の研究では、Cas9タンパク質による標的認識は、crRNA内の”シード”配列とcrRNA結合領域の上流の保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を必要とすることが示されている。 それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ｃｒＲＮＡを再設計することによって実質的に任意のＤＮＡ配列を切断するように再標的化することができる。 重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび必要なｃｒＲＮＡ成分を発現するプラスミドの同時送達によって、ヒト細胞に直接移植可能であることが

画像はhttps://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php

から撮影したものです。