- 要約
- 1. はじめに
- 2. 材料および試薬＜６ ０ ３ ２＞＜６ １ ５ ４＞細胞培養皿、フラスコ、遠心分離機管、および血清学的ピペットは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；＜９ ９ ４＞）から購入した。 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１ ２、ＨＥＰＥＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、０．０ ２％ＥＤＴＡ溶液、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット、およびＲｎｅａｓｙ（商標）キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；＜９ ２ １ ０＞）から入手した。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ；＜７ ９ ８ ６＞）から購入した。 マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９ ２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；＜８ ９ ３ ３＞）から入手した。 IIはロシュ出身であった。 ＡＢＣＧ２（クローンＢＸＰ−２ １）およびコネキシン４ ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡ ｂ）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ由来であり；ｐ６ ３（クローン４Ａ４）、Ｋ５およびＫ１ ９は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ由来であり；Ｋ３ｍＡｂ（クローンＡ Ｅ５）は、ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃ Ａ；＜７ ９ ４ ８＞）由来であった。 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５ ６ ８結合ヤギ抗マウス二次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；＜９ ２ １ ０＞）から入手した。 ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ−ＰＣＲおよびＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧキットは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ；＜３ ９ ７ ２＞）から入手した。 マイトマイシンＣ、ウシインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）、コレラ毒素、および他の試薬は、Sigma-Aldrich（St.Louis;http://www.sigmaaldrich.com/）から得た。 2.1. ヒト辺縁上皮細胞の単離と培養
- 2.2. コロニー形成効率アッセイ（CFE）
- 2.3. 細胞集団倍増アッセイ
- 2.4. RNA抽出と定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
- 2.5. 免疫蛍光染色
- 2.6. ウェスタンブロット分析
- 2.7. 統計
- 3. 結果
- 3.1. SR培地
- 3.2. CFEアッセイ
- 3.3. PCRおよびリアルタイムPCR解析
- 3.4. 免疫蛍光染色
- 3.5. ウェスタンブロット
- 4. ディスカッション
- 競合する利益
- 謝辞
要約
辺縁上皮細胞は、ウシ胎児血清補充培養培地を用いて3T3フィーダー層上に維持することができ、これらの細胞は辺縁幹細胞欠損の治療に成功している。 しかし、ウシ胎児血清には未知の成分が含まれており、定量的および定性的なロット間の変動が表示されます。 培養条件を改善するために，ヒト辺縁上皮細胞を培養するためのウシ胎児血清を置換するために定義されたノックアウト血清置換を検討した。 ヒト一次辺縁上皮細胞をノックアウト血清およびウシ胎児血清補充培地でそれぞれ培養した。 辺縁上皮幹細胞の細胞増殖速度，遺伝子発現および維持を研究し，これら二つの群間で比較した。 ヒト一次辺縁上皮細胞を単離し、この新規ノックアウト血清補充培地で正常に連続培養した; 細胞増殖と幹細胞維持はウシ胎児血清補充培地で増殖した細胞と同様であった。 これらのデータは，このノックアウト血清補充培地は辺縁上皮細胞培養のための伝統的なウシ胎児血清補充培地に効率的に置き換えられ，この培地は辺縁上皮細胞の長期維持，辺縁上皮幹細胞移植および組織再生のための大きな可能性を有することを示唆している。
1. はじめに
角膜上皮幹細胞は、辺縁の基底層に位置し、Vogtのpalisadesと呼ばれる波形で色素沈着した構造をしています。 これらの幹細胞は、生涯にわたって角膜上皮の連続的な再生を維持し、損傷または失われた角膜上皮細胞を置き換える。 辺縁系幹細胞欠損症（LSCD）および関連する眼表面疾患は、培養辺縁上皮自家移植を用いて正常に治療することができる。 これらの外科的治療の成功は、ほとんどの場合、3T3フィーダー層およびウシ胎児血清（FBS）を含む辺縁上皮幹細胞の効率的な拡張に依存する。 3T3フィーダー層培養システムはRheinwald and Greenによって設定され、ヒトの皮膚、毛包、辺縁、結膜、および口腔粘膜組織からの上皮細胞の拡張に成功しました。 しかし、FBSは明確に定義されておらず、常に定量的および定性的なロット間の変動が表示されます。 FBSはまた免疫学的な反作用を刺激し、動物の病気および病原体を送信するかもしれない可能性としては有害な異種の部品を含んでいます。 これらすべての懸念に伴い、従来のＦＢＳ補充培地に代わる明確に定義された培養培地を開発する必要性が増大している。＜５ １ ０ ６＞＜６ １ ５ ４＞現在、上皮細胞の増殖のための特定の無血清代替培地、例えば、ｄｅｆｉｎｅｄ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ無血清培地（ＫＳＦＭ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ増殖培地（ＫＧＭ（商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）、Ｅｐｉｌｉｆｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、および前駆細胞標的化（ＰＣＴ）培地（Ｃｅｌｌｎｔｅｃ（商標）、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が これらの製品は、角膜上皮細胞の拡張をサポートすることが示されています。 しかし、彼らはまだ、ウシ下垂体抽出物（BPE）またはヒト血清アルブミン（HAS）などの未定義の製品のサプリメントを必要としています。 そして、これらの培地のほとんどは、ヒト角膜上皮細胞の拡張のために実用的ではないかもしれない高い細胞播種密度を必要とする。 また、3T3培養系でホロクローンとして検出された角膜上皮幹細胞は、この無血清培養培地で長期的に維持することができなかった。 今日まで、角膜上皮幹細胞の長期的な拡張を支持することができる定義された無血清培地は存在しない。
ノックアウト血清置換（SR）は、胚性幹細胞（Esc）および人工多能性幹細胞（ipsc）の維持のためにFBSを直接置き換えるように設計された、定義された無血清 これは、ノックアウトSRは、ES細胞とiPSC培養のための一貫した成長条件を提供し、ノックアウトSR補充培地で成長したES細胞は、FBS補充培地で成長したも 上皮細胞とES細胞の培養方法の類似性を考慮し、ES細胞培養におけるFbsを置き換えるノックアウトSRの事実を考慮すると、ここではノックアウトSRが辺縁上皮細胞培養におけるfbsを置き換えるために使用できると仮定されている。
2. 材料および試薬＜６ ０ ３ ２＞＜６ １ ５ ４＞細胞培養皿、フラスコ、遠心分離機管、および血清学的ピペットは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；＜９ ９ ４＞）から購入した。 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’Ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１ ２、ＨＥＰＥＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、０．０ ２％ＥＤＴＡ溶液、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット、およびＲｎｅａｓｙ（商標）キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；＜９ ２ １ ０＞）から入手した。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）をＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ；＜７ ９ ８ ６＞）から購入した。 マウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９ ２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；＜８ ９ ３ ３＞）から入手した。 IIはロシュ出身であった。 ＡＢＣＧ２（クローンＢＸＰ−２ １）およびコネキシン４ ３に対するモノクローナル抗体（ｍＡ ｂ）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ由来であり；ｐ６ ３（クローン４Ａ４）、Ｋ５およびＫ１ ９は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ由来であり；Ｋ３ｍＡｂ（クローンＡ Ｅ５）は、ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃ Ａ；＜７ ９ ４ ８＞）由来であった。 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５ ６ ８結合ヤギ抗マウス二次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；＜９ ２ １ ０＞）から入手した。 ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ−ＰＣＲおよびＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ａｍｐｅｒａｓｅ ＵＮＧキットは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ；＜３ ９ ７ ２＞）から入手した。 マイトマイシンＣ、ウシインスリン、ヒトトランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）、コレラ毒素、および他の試薬は、Sigma-Aldrich（St.Louis;http://www.sigmaaldrich.com/）から得た。
2.1. ヒト辺縁上皮細胞の単離と培養
角膜-辺縁リングは、角膜移植直後に五つの健康なドナーから収穫され、インフォームドコンセントが求められ、サンプル収穫プロトコールは吉林大学のInstitutional Review Board（IRB）によって承認された。 新鮮な角膜-リンバルリングは0.25％Dispase IIで4℃で一晩処理し、上皮層は、下にある間質組織からスクラブし、0.05％トリプシン-0.02％EDTAで37℃で15分間処理した。 トリプシン活性を１ ０％ＦＢＳで中和し、解離した辺縁上皮細胞を回収し、１，５ ０ ０ｒｐｍで５分間遠心分離した。 上皮細胞の生存率は、染色を除くトリパンブルーによって決定され、細胞数は血球計を用いてカウントされた。
マウス3T3線維芽細胞は、10％FBS、L-グルタミン（2mM）、およびペニシリン-ストレプトマイシン（50IU/mL）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース）で維持され、5％CO2および加湿雰囲気で培養した。 3T3細胞は、6日ごとに80-90％の合流に達したときに継代培養した。 ３Ｔ３細胞を連続的に維持し、継代層の調製のために、継代２ ０の前の細胞のみを使用した。 フィーダー層を調製するために、コンフルエント3T3細胞をマイトマイシンC（10μ g/mL）で2時間37℃で処理し、PBSで二回洗浄し、0.05％トリプシンで5分間37℃で処理した。3T3線維芽細胞を収集し、上皮細胞を播種する一日前に30,000細胞/cm2の密度で播種した。
ヒト辺縁上皮細胞は、FAD培地または血清置換（SR）培地のいずれかを使用して3T3フィーダー層上で培養した。 ＦＡＤ培地は、１ ０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（２ｍ Ｍ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（５ ０ＩＵ／ｍｌ）、表皮成長因子（１ ０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μ ｇ／ｍｌ）、アデニン（０． ＳＲ培地は、１ ０％ノックアウトＳＲ血清補充液、Ｌ−グルタミン（２ｍ Ｍ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（５ ０ＩＵ／ｍｌ）、表皮成長因子（１ ０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μ ｇ／ｍｌ）、アデニン（１ｎＭ）、トリヨードチロニン（２ｎＭ）、トランスフェリン（５μ ｇ／ｍｌ）、およびセレン（５ｎｇ／ｍｌ）。 辺縁上皮細胞は6,000細胞/cm2の密度で3T3フィーダー層上に播種し、5％のCO2と加湿雰囲気で培養した。 FAD培地は3日ごとに変更され、SR培地は2日ごとに変更された。
2.2. コロニー形成効率アッセイ（CFE）
CFEアッセイのために、FAD培養またはSR培養から200ヒト辺縁上皮細胞をマイトマイシンc処理3T3フィーダー層を含む100mmペ 12日間の培養の後、皿を室温で10％ホルマリンで30分間固定し、1％ローダミンBでさらに30分間染色した。 蒸留水で洗浄した後、コロニー数を計数し、分析した。 コロニー形成効率は、形成されたコロニーの数を200で割ったものとして表された。
2.3. 細胞集団倍増アッセイ
辺縁上皮細胞は、FAD培地またはSR培地を使用してマイトマイシンc処理3T3フィーダー層上に維持されました。 上皮細胞は、80-90％の合流に達するとトリプシン化され、6,000細胞/cm2の密度で継代された。 文化は連続的に10通路のために維持されました。 各継代で、辺縁上皮細胞を採取し、細胞数を計数した。 各継代の母集団倍増数（ＰＤ）は、以下の式に従って計算された。: ここで、各通路で得られたセルの総数を表し、開始時のめっきセルの数を表す。
2.4. RNA抽出と定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
辺縁上皮細胞の遺伝子発現レベルを評価するために、PCRとリアルタイムPCRを行った。 製造業者の指示に従ってＲｎｅａｓｙキットを使用して角膜上皮細胞から全ＲＮＡを抽出した。 ＲＮＡを２ ６ ０ｎｍでのその吸収によって定量し、−８ ０℃で保存した。 ＣＤＮＡを合成するために、１μ ｇの全ＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔと共に使用した。 ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行い、リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、前に記載したプライマーを用いて行った。 リアルタイムPCR反応を、95℃で3分間の初期活性化ステップ、続いて45サイクル：95℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で40秒間実施した。 相対的な遺伝子発現は、サイクル閾値（δ Ｃ ｔ）の差を、遺伝子の値をグリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のδ Ｃ ｔ値に正規化することにより算出した。
2.5. 免疫蛍光染色
ヒト辺縁上皮細胞を、FAD培地またはSR培地中の3T3フィーダー層を有する培養スライドに播種した。 播種後三日、培養物を4％パラホルムアルデヒドまたは冷たいアセトンで4℃で10分間固定した。 ＰＢＳで２回洗浄した後、ｐｂｓ中の５％ヤギ血清で３ ０分間細胞をブロックした。 Ｐ６ ３（１：２ ０ ０、４Ａ４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＡＢＣＧ２（１：３ ０、ＢＸＰ−２ １、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｋ３（１：４ ０ ０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、およびコネキシン４ ３（１：１ ０ ０ ０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対するマウス一次抗体を塗布し、４℃で一晩インキュベートした。 次いで、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２（ＰＢＳ中１μ ｇ／ｍｌ）で２ ０分間対比染色した。 ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞培養物を装着培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ Ａ）で装着し、蛍光顕微鏡（Ｂ Ｘ５ ０）下で調べた。; オリンパス、東京、日本）。
2.6. ウェスタンブロット分析
培養した辺縁上皮細胞を、氷上でRIPA緩衝液(10mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1%デオキシコール酸ナトリウム、1%Triton X-100、1mM EDTA、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル;Roche Diagnostics)で30分間溶解した。 タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣ Ａ）タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して定量した。 全細胞溶解物（４ ０μ ｇ）を１ ２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で５％脱脂乳で１時間遮断し、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃ Ａ）、ＡＢＣＧ２（ＢＸＰ−２ １、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５ ０ ０ ０、ＨＲＰ抱合体、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、ｃ ａ）またはウサギ抗ヤギＩｇｇ（１：５ ０ ０ ０、ＨＲＰ抱合体、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、ｃ ａ）とインキュベートした。 : ５ ０ ０ ０、ＨＲＰ抱合体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃ Ａ）を室温で１時間、増強された化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて開発した。 ABCG2、PCNA、およびp63の発現レベルは、半定量的強度測定を用いて測定し、内部対照として役立ったGAPDHレベルに正規化した。
2.7. 統計
CFEのデータの概要とリアルタイムPCRの相対倍は平均±SDとして報告され、Microsoft Excel（2003/XPバージョン）と学生の対なしテストを使用して比較されました。 試験結果は両側値として報告され、統計的に有意であると考えられた。
3. 結果
3.1. SR培地
における角膜上皮幹細胞の表現型は、合計5つの角膜輪環組織が32-65歳の年齢範囲のドナーから採取された。 これらの組織を保存し、収穫後24時間以内に処理した。 ヒト一次角膜上皮細胞培養は、FAD培地（図1（a）および1（b））およびSR培地（図1（c）および1（d））においても正常にセットアップされた。 SR培地+3T3フィーダー層に維持された角膜上皮細胞は、典型的な未分化上皮細胞の形態である小さなサイズと高い核/細胞質比との形態を示し、大きな分化扁平扁平様細胞はめったに観察されなかった(図1(c))。 SR培地中に維持された上皮細胞は、播種後3日後にコロニーを形成し始めた（図1（c））。 これらのコロニーのサイズは、FAD培地+3T3フィーダー層内に形成されたものと同様であった（図1（a））が、これらのコロニーは、FAD+3t3フィーダー層のものよりも 7日以内に、上皮細胞は均一な小さなサイズのSR培地中で合流に達し（図1（d））、これはFAD培養でも観察された（図1（b））。 本研究では、ヒト角膜上皮細胞が誘導され、すべての五つのドナーのためのSR培地+3T3フィーダー層に維持することができます。 長期培養のために、ヒト角膜上皮細胞は、SR培地+3T3フィーダー層で連続的に10以上の通路（）継代培養した。 各継代の間に、細胞はトリプシン化され、細胞が80-90％の合流に達したときに収集された;細胞数は、集団倍増アッセイのために計算された。 その結果、図2(a)に示すように、SR培地からの上皮細胞収量はFAD培地で培養した細胞の収量に近く、これらのデータは以前の報告と同様であることが示 要約すると、ここで提示されたデータは、SR培養培地+マイトマイシンC処理3T3フィーダー層は、ヒト角膜上皮細胞クローンの成長および増殖をサポートしてい
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3.2. CFEアッセイ
次に、FADおよびSR培地で培養した角膜上皮細胞のCFEを検討し、比較しました。 CFEを分析するために、SRおよびFAD培地で培養された角膜上皮細胞を採取し、200細胞あたり100mmペトリ皿の密度で播種し、マイトマイシンc処理3T3フィーダー層でpreseededし、この培養を12日間増殖させた。 角膜上皮細胞は、培養開始後5-7日後にコロニーを形成し始めた。 図2(b)に示すように、12日間培養した後、SR培地に維持された角膜上皮細胞は、FAD培地に維持された細胞と比較して同様のCFEおよびコロニーサイズを示した。 Ｓ ｒおよびＦＡＤ培地中の上皮細胞に対するＣＦＥ値は、それぞれおよびであった（図２（ｃ））。 統計的解析により、SR培地とFAD培地の間でコロニー形成効率（）およびコロニーの平均面積（）に有意差がなかったことが示された（図2（c））。 我々は、コロニーの面積に基づいてコロニータイプの割合を定量化した。 結果は、SR培地で形成された中絶コロニー（コロニー面積<1mm2）の割合は、FAD培地（）内のそれと同様であったことを示した。 同様に、SR培地で形成された大きなコロニー（コロニー面積>4mm2）の割合は、FAD培地（）に近かった（図2（d））。 これらの結果は，ＳＲ培地で培養した角膜上皮細胞は，ＦＡＤ培地で培養した細胞と比較して同様の高い増殖能を有することを示している。
3.3. PCRおよびリアルタイムPCR解析
遺伝子発現を調べるために、FADおよびSR培地の両方で培養した上皮細胞に対してPCRおよびリアルタイムPCRを行った。 ハウスキーピング遺伝子GAPDHは、内部統制として使用されました。 ＰＣＲデータは、ＦＡＤ培地およびＳＲ培地の両方で培養された細胞が、増殖マーカー ＰＣＮＡの高レベルの転写産物発現を示すことを示す。 両方の培地中の細胞は、サイトケラチン3およびサイトケラチン12の陽性発現を示し、これはそれらの辺縁起源と一致している。 基底層上皮細胞マーカー、サイトケラチン15の陽性発現も両方の培養で観察された。 ABCG2発現は、SR培地中の初代培養後にわずかに減少したが、ABCG2とΔ Np63Α発現は、両方の培養で検出された。 コネキシン43発現の低レベルは、両方の培養で観察され、両方のメディアにおける上皮細胞分化の低レベルを暗示した。 リアルタイムPCRのために、mRNAレベルの定量分析は、FADおよびSR培地中で成長した上皮細胞の間に、p63およびABCG2の有意な発現差（）がないことを示した（図4（a））。 角膜上皮分化マーカーサイトケラチン3およびサイトケラチン12のリアルタイム解析も行われた。 これら二つのマーカーの両方は、FADとSR細胞培養の両方でかろうじて検出可能であった、と、驚くべきことに、これら二つの培養の間に発現レベルに有意差（）
3.4. 免疫蛍光染色
SR培地で増殖した上皮細胞が幹性および未分化状態を維持していることを確認するために、いくつかの増殖、分化、および推定される上皮幹細胞マーカーの免疫蛍光染色を行った。 図4に示すように、SR培地では、ほとんどの上皮細胞は小さく均一な形態を示し、ほとんどの細胞は推定上皮幹細胞マーカーであるp63で強く染色された。 ABCG2陽性染色細胞はまた、辺縁上皮細胞コロニー内の斑状分布で観察された。 SR培地に維持された細胞は、コネキシン43およびサイトケラチン3に対して弱く染色された。 これら二つの分化マーカーの発現が低いことは，細胞培養における上皮細胞分化のレベルが低いことを示唆した。 同様の染色スタイルは、ＦＡＤ培地で維持された細胞においても観察された（図４（ｂ））。 これらのデータは，ＳＲ培地で培養したヒト辺縁上皮細胞は推定上皮幹細胞マーカーの高レベルの発現を維持し，分化マーカーの低レベルを発現していることを示唆している。
3.5. ウェスタンブロット
定量的遺伝子発現と免疫蛍光染色結果をダブル確認するために、潜在的な上皮幹細胞マーカー（P63およびABCG2）と増殖マーカー（PCNA）の発現をウェスタンブロットを用いて評価した。 モノクローナルp63抗体（クローン4A4、Santa Cruz）を使用して、P63タンパク質（70KD、Δ N Αアイソフォーム）は、SR培地中の高発現レベルで検出された。 ＡＢＣＧ２（７ ０ＫＤ）の発現は、ＳＲ培地中で培養された細胞の各継代において検出された。 PCNA、増殖マーカーは、SR培地で培養した細胞でも検出された（図3(c))。 また、p63、ABCG2、およびPCNAの発現レベルは、内部対照としてGAPDHを使用した半定量的強度測定（図3（d））を用いた10継代において同様であった。
(a)
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4. ディスカッション
3T3フィーダー層上で培養された上皮細胞は、重度の火傷、糖尿病性足潰瘍、皮膚欠損、口腔粘膜欠損などの様々な臨床状況の治療に成功裏に誘導され、使用されている。 辺縁上皮幹細胞の最初の移植は、1997年にPellegriniらによって記載された。 . 過去数十年の間に、3T3フィーダー層の有無にかかわらず、ヒト羊膜（HAM）上の辺縁上皮細胞の培養、温度応答性プレート上の上皮細胞の培養、市販の無血清培養培地での上皮細胞の培養など、いくつかの異なる培養方法が開発されている。 角膜-辺縁上皮細胞移植の臨床成績は、辺縁幹細胞が細胞培養中に保存されているかどうかに依存することが最近の報告で示されているように、ホロクロンはFAD+3T3培養系にのみ保持されていることが指摘されている。 この培養プロトコルはFBSを使用することを含むため、FBSは動物製品の定義が不十分であり、動物由来の疾患を患者に伝達する可能性があるという安全性の懸念が高まっています。 従って従来のFAD媒体を取り替えるために動物プロダクトなしおよびFBSなしの培養基を開発する増加する必要性があります。
本研究では、ノックアウトSRがFBSに置き換えられた新規無血清培養培地を開発しました。 この新規無血清培養培地における辺縁上皮幹細胞の表現型は、提案された幹細胞マーカー（p63、ABCG2）および分化マーカー（サイトケラチン3、コネキシン43）の抗体
核転写因子p63は以前に上皮幹細胞のマーカーであることが提案されており、Δ N Αはこれらの細胞におけるp63アイソフォームの優勢なアイソフォームで 私たちの結果は、これらの以前の報告と一致しています; 核p63は強く免疫染色、リアルタイムPCR、およびウェスタンブロットによって示された辺縁細胞培養で発現していた。 辺縁細胞培養におけるp63の存在は、その高い増殖性および自己再生の可能性を示している。 ABCG2、もともと乳癌耐性タンパク質1（BCRP1）として知られているATP結合カセット（ABC）トランスポーターのメンバーは、辺縁上皮幹細胞を含む成体幹細胞のための別の推定幹細胞マーカーとして提案されている。 SR培地中のABCG2の高発現は、免疫染色およびリアルタイムPCRによって証明された。
k3とk12は角膜特異的マーカーとしてよく知られています。 一貫して、我々の免疫染色およびリアルタイムPCR結果は、細胞がK3およびK12陰性であり、それらの辺縁起源を確認することを示した。 Connexin43はギャップの接続点蛋白質家族のメンバーである;それは近隣の細胞間の低分子量の溶質の直接拡散を可能にする。 コネキシン43は、分化した上皮細胞によって発現されることが報告されており、これらの細胞間通信分子の不在は、上皮幹細胞の特徴であり得る。
我々の結果では、より多くの割合の細胞がp63およびABCG2を発現したが、少数の細胞が分化マーカー K3/K12およびCX43を発現した。 したがって、SR無血清培地中のヒト辺縁上皮幹細胞は、FBS培地と比較して、同様の表現型を示し、未分化状態を維持する。
結論として、Fbsを置き換えるノックアウトSRを使用して、私たちの新しい無血清培地は、ヒト角膜上皮細胞の成長と増殖を維持し、その未分化表現型 この新しい無血清培養法は補足定義され、制御が比較的容易である。 それに医院の辺縁上皮細胞の移植およびティッシュの再生で使用される大きい潜在性があります。
競合する利益
著者らは、競合する利益を持たないと宣言している。
謝辞
この研究は、吉林大学および中国国家自然科学財団（NSFC30500548）からの助成金によって支援されました。
