K48結合Ub鎖は、複数の立体配座の間で動的に変動
我々は、リガンドフリー K48-diUbにおける二つのUbサブユニットの空間的配置を評価するためにsmFRETを使用しました。 本発明者らは、遠位Ｕ ＢのＮ末端および近位Ｕ ＢのＣ末端に、フルオロホア、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８およびＣｙ５を導入した（補足図４）。 S1a）。 期待値最大化アルゴリズム32を使用すると、K48-diUbのsmFRETプロファイルは、三つの重複するFRET種として最もよく記述することができます（補足図。 S2）。 高、中、および低フレット種は、0.74、0.57および0.23のフレット効率を中心とし、それぞれの個体群は〜48、〜39、および〜13％である（図10B）。 1a）。 蛍光体の中心間のフレット距離は、それぞれ-43、-50、-64Åで計算されます。 したがって、高、中、および低フレット種は、K48-diUbのために存在しているコンパクト、半オープン、およびオープン状態に割り当てることができます。
近位Ｕ Ｂの７ ６Ｃ部位および遠位Ｕ Ｂの０Ｃ部位に抱合した蛍光体を有するａ（参照。 補足図。 S1a）は、smFRETのプロフィール三つの重複の焦燥種に合うことができる。 特に記載のない限り、この抱合部位の対は、Ｋ４ ８−ＤＩＵＢの全てのＳＭＦＲＥＴ研究に使用される。 高フレット種（赤色）は、既存のコンパクト状態に対応する。 b-dコンパクト状態は、全長Rpn13によって選択的に濃縮することができ、人口増加は結合等温線に適合させることができる。 例えば、コンパクトな状態は、Rpn13Ntdによって選択的に濃縮することができ、人口増加は、結合等温線であるように適合させることができる。 h n25C/N25Cサイトで共役フルオロホアと、Rpn13Ntdは選択的にK48-テトラブの遠位diUbの既存のコンパクトな状態を豊かにすることができます（cf。 補足図。 Ｓ５）、結合親和性を与える。 SmFRET種の集団は、1SDを示す誤差で、三つの独立した測定にわたって平均化され、KD値は、最良適合±フィッティング誤差として報告されています
K48-diUbの立体配座ゆらぎは、以前にsmfret26を使用して調べられています。 その研究では、著者らは、K48-diUbの二つのsmFRET種、すなわち0.69と0.41でセンターフレット効率を持つ高フレットと低フレット種、無フレット種に加えて、それぞ 著者らは、不活性化OTUB1（Otub1I）、K48イソペプチドlinkage33に特異的なdeubiquitinaseの滴定は、主に低フレット種を豊かにすることを示した。 彼らの観察は、K48-diUbは、コンフォメーション選択機構を介してOTUB1によって特異的に認識することができるという提案につながった。 ここでは、ＳＭＦＲＥＴ滴定を繰り返し、Ｏｔｕｂ１Ｉが中ＦＲＥＴ種を豊かにすることを見出した（補足図１）。 S3a-c）。 さらに、Otub1I滴定時の中フレット種の人口増加は、7.7±0のKD値を有する結合等温線に適合させることができる。1μ m（補足図。 S3d)、これは以前に報告されたKD値に近い26。 したがって，本研究における中フレット種は以前の研究における低フレット種に対応すべきであり，不一致は異なる光子計数効率とｓｍｆｒｅｔ時間トレースのフィッティングルーチンから生じる可能性がある。
さらに、K48-diUbが三つの既存の配座状態の間で変動することを確認するために、我々はフルオロフォア共役サイトの追加のペアでフルオロフォアを導入 S1b-d）。 代替部位については、ＦＲＥＴ種の中心効率は異なるが、ＳＭＦＲＥＴプロファイルは、類似の集団を有する３つの重複するＦＲＥＴ種として記載することができる（補足図１）。 S4）。 例えば、25C/25C抱合部位については、高、中、および低FRET種は、0.68、0.54および0.21のFRET効率を中心とし、それぞれの集団は〜48％、〜43％、および〜9％である（補足図 S4d）。 したがって、fluorophoresの共役は、タンパク質構造を乱すことはほとんどありませんし、smFRET測定に関係なく、共役サイトのK48-diUbの固有の立体配座ダイナミクスを明
さらに長いK48リンクUb鎖のUbサブユニットも複数の配座状態の間で変動するかどうかを評価するために、我々はK48リンクテトラユビキチン（K48-tetraUb）のsmFRETプロ 我々は、K48-tetraUbの遠位diUb（近位diUbに尊敬と）の二つのN25Cサイトでフルオロホアを共役。 ＳＭＦＲＥＴプロファイルは、３つの重複するＦＲＥＴ種として適合させることもできる（補足図１）。 S5a）。 3種の相対的な個体群は、同じ部位に共役した蛍光体を有する単離されたK48-diUbの個体群とは異なるが（補足図10）、単離されたK48-diUbの個体群は、単離されたK48-diUb S4d）、フレット種のセンターフレット効率はほぼ同一である。 したがって、diUbユニットの立体配座状態は、より長いK48結合Ub鎖に保存される可能性が高いが、相対集団の差は近位diUbの調節効果の結果であり得る。
高フレット種は、選択的にRpn13によって濃縮されています
K48リンクUb鎖とRpn13認識の立体配座ダイナミクスとの関係を評価するために、我々は150pMフルオロフォア標識K48-diUbをヒト全長Rpn13タンパク質と滴定した。 興味深いことに、１ ０ ０ｎＭのＲｐｎ１ ３を添加すると、既存の高ＦＲＥＴ種のＫ４ ８−ＤＩＵＢは、約４ ８％から約５ ７％まで濃縮される（図１ ０Ａ）。 1a、b）、中フレット種および低フレット種の個体数は減少するが。 高フレット種の個体数は、より多くのRpn13が添加されるとともに増加し続けている（図。 結合等温線は、１ １ ９±２ ４ｎＭのＫＤ値に適合させることができる（図１Ｃ）。 1d）。
Rpn13Ntdが主にUb結合に関与していることが以前に示されています6,7。 したがって、我々は、最初の150残基のみを含むRpn13Ntdのみを使用して150pMフルオロフォア標識K48-diUbのsmFRET滴定を行った。 また、ＲＰＮ１ ３ＮＴＤは、Ｋ４ ８−ＤＩＵＢの高ＦＲＥＴ種を選択的に富化する（図１ ０Ｂ）。 1e、f）。 高フレット種の個体群増加は、33.1±6.9nMのKD値を得られるように適合させることができる（図10A）。 これは、全長Ｒｐｎ１ ３と比較して親和性の約４倍の増加である。 蛍光色素が代替抱合部位に付着している場合（補足図）。 Ｓ１ｂおよびＳ４Ｂ）、Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄの滴定はまた、同様の傾向に続く同等のＦＲＥＴ種の濃縮を引き起こし、ほぼ同一のＫＤ値を与える（補足図１ ０Ａおよび１ ０Ｂ）。 S6）。 したがって、外観追加の残基は、Rpn13NtdとK48-diUbとの間の相互作用に対する小さな阻害効果を有し得る。
さらに、遠位diUbに共役したフルオロホアを用いて150pM K48-tetraUbに対してsmFRET滴定を行った（補足図。 S5a）。 Rpn13Ntdの滴定は、選択的にフルオロフォア標識遠位diUbの既存の高フレット種を豊かにする（補足図。 結合等温線は、２ １ ４±７ ０ｎＭのＫＤ値に適合させることができる（図５Ｂ−ｄ）。 1時間）。 Rpn13Ntdと比較して結合親和性の7倍の減少：K48-diUb相互作用は、遠位diUbと近位diub34との間の自己会合に起因することができ、結合表面はRpn13結合のために利用 重要なのは、K48-diUbまたはK48-tetraUbのすべてのsmFRET滴定のために、高フレット種の中心効率は、Rpn13またはRpn13Ntdの不在または存在下ではほとんど変化しない。 これは、Ｒｐｎ１ ３が、ｋ４ ８−ＤＩＵＢがそれ自体であるか、またはより長いＵ Ｂ鎖の一部であるかにかかわらず、立体配座選択機構を介してＫ４ ８−ＤＩＵＢの既存の立体配座に結 また、高フレット種、すなわちK48-diUbの既存のコンパクトな状態は、完全に閉じておらず、他のタンパク質と相互作用する準備ができていることを意味 重要なことに、高フレット種の選択的濃縮はまた、Rpn13が同時に両方のUbサブユニットと相互作用する必要があることを示しています。
Rpn13がk48結合diUbに優先的に結合する
K48結合に対するRpn13結合特異性を評価するために、Rpn13と他のタイプのUbタンパク質との結合親和性 １ ５ ０ｐＭのフルオロフォア標識Ｋ４ ８−ＤＩＵＢへの２ ０ ０ｎＭのｒｐｎ１ ３Ｎｔｄの滴定により、高ＦＲＥＴ種の個体群は、約４ ８％から約６ ３％に１ ５％増加する（図１ ０Ａ）。 1階）。 この濃度では、Ｋ４ ８−Ｄｉｕｂ結合は、Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄではまだ飽和していない（図１ ０Ａ）。 したがって、高フレット種の個体群は、利用可能なRpn13Ntd濃度の小さな変化に敏感である。 標識されていないＫ４ ８−ＤＩＵＢは、フルオロフォア標識Ｋ４ ８−ＤＩＵＢとＲｐｎ１ ３Ｎｔｄへの結合を競合させることができる。 １ ５ ０ｐＭの非標識Ｋ４ ８−ｄｉｕｂの添加により、高ＦＲＥＴ種の個体群は、Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄ結合フルオロフォア標識ｋ４ ８−ｄｉｕｂの５ ０％の阻害に対応して、７． 2a）。 ３ ０ ０ｐＭの標識されていないＫ４ ８−ＤＩＵＢの添加により、高ＦＲＥＴ種の個体群は１ １％減少し、合計７ ３％の阻害になる（図１ ０Ａ）。 2b）。 そのようなものとして、フルオロフォア標識および非標識K48-diUbの両方が、同様の結合親和性を有するRpn13上の同じ結合界面を競合する。 これはまたK48-diUbへのfluorophoresの共役がRpn13NtdとK48-diUb間の相互作用に少し摂動を引き起こすことを意味します。
200nMのRpn13Ntdのa、bの付加は最初にfluorophore分類されたK48-diUbの高フレット種を富ませる(cf. 図1f)、さらに150pMおよび300pMの標識されていないK48-diUbの添加は、高フレット種の個体数を減少させる。 c、150pMおよび300pM非標識Ubモノマーのd添加は、高フレット種の集団に無視できる影響を持っています。 e、f150pM K48-diUbおよび150pM M1-diUbの添加は、高フレット種の個体群の非常に小さな減少を引き起こす
さらに、200nMのRpn13Ntdと150pMフルオロフォア標識K48-diUbの混合物に、我々はUbの他のタイプはK48-diUbを変位できるかどうかを評価するために、非標識Ub単量体、K63 高フレット種の個体群は、150pMまたは300pMのUb単量体の添加によってほとんど変化しない（図。 2c、d）。 １ ５ ０ｐＭのＫ６ ３−ＤＩＵＢおよび１ ５ ０ｐＭのＭ１−ＤＩＵＢを添加することにより、高ＦＲＥＴ種の個体群も誤差範囲内で変化しない（図１ ０Ａ）。 2e、f）。 一方、フルオロフォア共役K63-diUbおよびM1-diUbへの1μ m Rpn13Ntdの直接滴定は、それらの既存のsmFRETプロファイルにほとんど変化を引き起こさない（補足図。 S7）。 一緒に、Rpn13Ntdは選択的にK48-diUbと相互作用します。
Rpn13Ntdの溶液構造:K48-diUb複合体
Rpn13Ntdがk48-diUbと選択的に相互作用することが示されているが、Rpn13NtdとUb単量体の間の複雑な構造のみが決定されている6,8。 K48-diUbの二つのサブユニットが同時にRpn13Ntdと相互作用することができる方法を理解するために、我々はRpn13Ntdの溶液構造を決定するために着手した：k48-diUb複合体は核磁気共鳴（NMR）を用いている。 タンパク質複合体が形成されると、界面残基は異なる局所環境を経験し、したがってNMRシグナルを表示する。 本発明者らは、標識されていないＫ４ ８−ＤＩＵＢを１ ５Ｎ標識Ｒｐｎ１ ３に滴定することにより、主に残基７ ３〜８ ３および９ ３〜１ ０ ６を含む大きな化学シフト摂動（Ｃｓｐ）を引き起こ 3a）。 これらの残基はRpn13上に連続した表面を形成し、Rpn13NtdとUbモノマー6,7の間の以前に決定された複雑な構造から予想よりも大きな面積をカバーする。 一方、k48-dUbに非標識Rpn13Ntdを滴定、近位または遠位Ub15N標識と非標識他のサブユニットのいずれかで、CSPsは、主に両方のUbサブユニットのβシート領 界面残基のいくつかは、複合体の形成時にも消失した（Fig. 3b、c）。
a-c CSPは、1Hと15N次元のバックボーンアミドプロトンの0.2mM同位体標識および非標識タンパク質との複合体の形成時に平均した。 インセット：15N標識されたサブユニットは、表面表現で示されており、赤色の残基は、点線の上にCspを持っています。 d、遠位UbのE24Cサイトで共役常磁性プローブとe、常磁性と反磁性スペクトルの間の強度比、およびPRE Σ2値は、15N標識Rpn13Ntdのバックボーンアミドプロト 灰色のボックスは非常に大きな分子間PREsを持つ残基を示した。 近位UbのN25Cサイトで共役常磁性プローブとf、Φ2値は15N標識遠位Ub K48diUbのアミドプロトンを測定しました。 エラーバーは1S.D.を示します。、および複合体内で完全に広がった残基は、星で示されています
核オーバーハウザー効果（NOE）は、核間の距離関係（<6Å）を報告している。 さらに、13C半ろ過NMR実験は、12C結合プロトンと13C結合プロトン、すなわち分子間距離関係の間のNOEを提供することができます。 本発明者らは、Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄと近位Ｕ Ｂとの間、Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄと遠位Ｕ Ｂとの間、および近位Ｕ Ｂと遠位Ｕ Ｂとの間の分子間Ｎｏ Ｅを得た（補足図４）。 S8）。 さらに、我々は遠位UbのE24Cサイトでマレイミド-EDTA-Mn2+常磁性プローブを共役し、確立されたprotocol22、35に続いて、rpn13Ntdのバックボーンアミドプロトンの常磁性緩和 常磁性対反磁性スペクトルのピーク強度比または横断緩和増強Γ2速度のいずれかによって評価されるように、Rpn13残基30-42および101-106は、重度の線拡 3d、e）。 また、近位UbのN25Cサイトで常磁性プローブを共役し、遠位Ubの横緩和増強速度Φ2を評価した（図。 3階）。 大きなPRE値は、リガンドフリー K48-diUbの二つのUbサブユニットの間で観察され、Rpn13Ntdの添加は、Ub PREs間が、同様のPREプロファイルを増加させます。 事前NMR実験は、このようにRpn13NtdはK48-diUbの既存のコンパクトな状態を豊かにすることを確認します。
Rpn13Ntdを改良するには:K48-diUb複合体構造実験的拘束に対して、我々はdiUbリンカー残基と界面残基の側鎖に与えられたねじり角自由度を持つ剛体ドッキングを行った。 20の最低エネルギー配座については、すべての剛体残基の骨格重原子の二乗平均平方根（RMS）偏差は0.86±0.54Åである（補足図。 Ｓ９およびテーブルＳ１）。 K48-diUbの二つのUbサブユニットは、-1130Å2の溶媒アクセス表面積（SASA）を埋め、複合体に関連付けられたままです。 一方、Rpn13Ntdは、近位UbとSASAの-940Å2を埋め込み、遠位UbとSASAの-1300Å2を埋めている（図。 4a）。 本研究におけるK48-diUbのrpn13Ntdと近位Ubとの間の複雑な構造は、rpn13Ntdとub単量体6,7との間の既知の複雑な構造に似ており、骨格重原子のRMS差は2.17±0.31Åである（補足図。 ———– 興味深いことに、近位Ubの疎水性残基L8、I44およびV70はRpn13との相互作用に関与しているが、遠位Ubの同じ三つの残基は、Ub-Ub界面に埋もれている。
Rpn13Ntdの構造:K48diUbの複合体。 複合体の形成は、サブユニット間の広範な界面を埋める。 b Rpn13Ntdの静電ポテンシャル表面とk48-diUbの遠位Ub、±3kBTスケールで描かれています。 遠位Ｕｂ中のｒｐｎ１ ３Ｎｔｄ中の残基Ｒ１ ０ ４およびＤ３ ９は、ボールおよびスティックとして示される。 ＲＰＮ１ ３ＮｔｄにおけるＣ Ｒ１ ０ ４Ｅ電荷反転突然変異は、ＳＭＦＲＥＴによって評価されるように、Ｋ４ ８−ＤＩＵＢに対する結合親和性の３ ０ ０倍の減少を引き起こす（ｃｆｃ−１ ０ ４ｅ、ｃｆｃ−１ ０ ４ｅ、ｃｆｃ−１ ０ ４ｅ、Ｃｆｃ−１ ０ ４Ｅ、Ｃｆｃ− 補足図。 S11）。 ＫＤ値は、最良適合±適合誤差として報告される。 dウェスタンブロット分析は、Rpn13R104E変異体（N末端フラグ付き）のトランスフェクションは、細胞内のK48リンクpolyUbタンパク質の全体的な量を増加さ 熱ショック時のe細胞の生存率（熱ショックのない細胞と比較して）は、rpn13r104E変異体のトランスフェクションが、野生型Rpn13のトランスフェクションが熱耐性を付与することを示している。 *P<0.05,***P<0.05,***P<0.05,***P<001、同じグループ内の細胞を対照するために、対のないt検定;##P<0.01、###P<0.001、熱ショックを有する未処理の細胞に対して、一方向ANOVA;&&P< 0.01, &&&P<0.001、熱ショックを有する野生型Rpn13トランスフェクト細胞に対して、一方向ANOVA
Rpn13Ntd:K48-diUb複合体構造は、単一分子のFRETデータによっても確証することができます。 複雑な構造に基づいて、我々はK48-diUbのそれらの共役サイトで蛍光体をモデル化しました。 平均距離は43.2±5です。フルオロフォア芳香族環の幾何学的中心間の8Åは、0.73±0.13の理論的なフレット効率に相当する（補足図。 （2010年10月10日）。 この値は、高フレット種で観測された中心効率とほぼ同じです（図。 1a）。
rpn13Ntdの破壊：遠位Ub相互作用は、細胞内のユビキチン化タンパク質の蓄積を引き起こす
Rpn13NtdとK48-diUbの間の複雑な構造において、rpn13Ntdと近位Ubの間の相互作用は、以前に報告されているように、Rpn13NtdとUb単量体の間の相互作用と同様である。 ———– したがって、我々はRpn13Ntdとk48-diUbの遠位Ubとの間の相互作用のための機能的重要性を評価するための実験を設計しました。 多くの荷電残基は、Rpn13NtdとK48-diUbの遠位Ubとの間の界面に位置しており、したがって、静電力は複合体を安定化させるために重要な役割を果たす可 4b）。 その中で、遠位Ｕ ｂ中の残基Ｄ３ ９は、Ｒｐｎ１ ３中の残基Ｒ１ ０ ４に近い。 我々は、このようにグルタミン酸にRpn13残基R104を変異させ、フルオロフォア標識されたK48-diUbに変異Rpn13Ntdを滴定した。 変異タンパク質は、Ｋ４ ８−ＤＩＵＢの高ＦＲＥＴ種を富化する（補足図１）。 S11）。 しかし、結合親和性ははるかに弱くなる。 結合等温線は、野生型Rpn13Ntdよりも約300倍弱い10.0±3.3μ MのKD値に適合させることができる（図10B）。 4c）。 そのようなものとして、遠位Ｕ Ｂとの関連は、Ｒｐｎ１ ３とＫ４ ８−ＤＩＵＢとの間の特異的認識にとって重要である。
R104e変異体の結合親和性の低下により、Rpn13とK48結合Ub鎖との間の相互作用の機能的重要性を評価することができました。 野生型Rpn13の一過性トランスフェクションは、K48結合polyUbタンパク質の量をわずかに増加させる（図。 4d）。 これは、rpn13トランスフェクション時に、遊離Rpn13の過剰量は、このようにプロテアソームにユビキチン化基質タンパク質の募集はあまり効率的に、プロテ 一方、rpn13R104E変異体のトランスフェクションは、野生型Rpn13をトランスフェクトした細胞と比較して、K48結合polyUbタンパク質の量を大幅に増加させる（図。 4d）。 陽性対照として、我々は1μ m MG132、強力なプロテアソーム阻害剤36と細胞をインキュベートした。 不安定な蛋白質の低下の妨害が原因で、MG132の付加はかなりk48連結されたpolyUb蛋白質の量を増加します。 一緒に取られて、Rpn13のR104Eの突然変異はユビキチン化された基質蛋白質の蓄積をもたらすことができます。 これは、プロテアソーム関連Rpn13変異体とK48-diUbとK48-poyUbとの間の弱い相互作用に起因することができます。
熱ショックは細胞の生存率を低下させる可能性があります。 我々は、30分の熱ショック43℃でHEK293細胞の生存率を75％に減少させることができることがわかった。 以前の報告36、37と同様に、本発明者らはまた、MG132の処置が、熱ショック時の細胞生存に対して保護効果を有し、細胞生存率が〜90％に低下することを見出した（図36、37）。 4e）。 これは、MG132がプロテアソームの分解を阻害し、それ以外の短生存熱ショックタンパク質をより利用可能にするためである（図。 4d）。 我々はまた、野生型Rpn13をトランスフェクトした熱ショック細胞の生存率をアッセイし、Rpn13トランスフェクションなしでコントロール細胞から有意差 一方、ｒｐｎ１ ３ｒ１ ０ ４Ｅ形質移入細胞の細胞生存率は、熱ショック時に〜８ ３％まで減少し、これは、対照細胞および野生型Ｒｐｎ１ ３を形質移入した細胞のそれよりも有意 4e）。 これは、変異体Rpn13がMG132の効果と同様に、熱ショック時の細胞生存に対する保護効果を有することを意味する。 Rpn13の界面点突然変異は、熱ショックタンパク質などの特定の基質タンパク質の蓄積を引き起こし、トランスフェクトされた細胞にthermotoleranceを与えるこ
Rpn13Ntd:K48-diUb相互作用は、Rpn13機能を調節するために標的とすることができます
Rpn13は、rpn13NtdとRpn27,13のC末端尾部との間の相互作用を介してプロテ ここでの複雑な構造は、Ｒｐｎ２に対するＲｐｎ１ ３Ｎｔｄ上の結合界面が、Ｋ４ ８−ＤＩＵＢの遠位Ｕ Ｂに対する結合界面に近いが、重複しないことを示している（図１ ０Ａ）。 5a）。 我々はこのようにrpn2の最後の16残基（Rpn2Ctd）rpn13Ntdまたは全長Rpn13と1：1の比で事前混合し、rpn13Ntdを滴定：rpn2Ctd複合体フルオロフォア標識K48-diUbに。 Rpn2Ctdの予混合は、Rpn13Ntd:K48-diUbのKD値を33.1±6.9nMから増加させた（図10aおよび10b）。 1g）に66.8±13.9nM（補足図。 Ｓ１ ２Ａ−ｃおよび図１ ２ｂおよび図１ ２ｂを参照。 のＫＤ値を１ １ ９±２ ４ｎＭから減少させた（図５Ｂ）。 1d)に43.9±12.8nM(補足図。 Ｓ１ ２ｄ−ｆおよび図１ ２ｄ−ｆを参照。 5c）。 したがって、測定の不確実性を提供する、Rpn2Ctdの会合はまた、リンカーの存在とRpn13のC末端ドメインと関係している可能性があり、Rpn13とK48-diUbとの間の結合親和性のための唯一の小さな摂動を引き起こします。
ａ Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄ上のｋ４ ８−ＤＩＵＢの遠位Ｕ Ｂの結合面は、Ｒｐｎ２Ｃｔｄの結合面に隣接している。 Rpn13Ntd-Rpn2Ctd複合構造（PDBコード5V1Y）をRpn13Ntdによって重ね合わせたもので、Rpn2Ctdは赤い漫画として示されています。 Ｒｐｎ１ ３残基Ｋ３ ４は、遠位Ｕ ｂのＣ末端に近い（点線で示す）。 ｂ、ｃ結合親和性は、等モルＲｐｎ１ ３Ｎｔｄ：Ｒｐｎ２Ｃｔｄまたはｒｐｎ１ ３：Ｒｐｎ２Ｃｔｄのフルオロフォア標識Ｋ４ ８−ＤＩＵＢに対するＳＭＦＲＥＴ滴定から得た。 ＫＤ値は、最良適合±適合誤差として報告される。 Rpn2アンカー Ubモノマーのd結合は、おそらく後者の変位を引き起こし、遠位Ubの同じ結合表面を占めています。 ｅ、ｆ２ ０ ０ｎＭのｒｐｎ１ ３Ｎｔｄまたは全長Ｒｐｎ１ ３および１ ５ ０ｐＭのフルオロフォア標識Ｋ４ ８−Ｄｉｕｂの混合物に、１ ５ ０ｐＭのＲｐｎ２Ｃｔｄ−Ｕ Ｂ融合タンパク質をさらに添加したＳＭＦＲＥＴ競合実験（ 誤差は、smFRET種の集団の三つの独立した測定から1S.D.を示しています
Rpn2とk48-diUbの遠位UbはRpn13Ntd上の近くの表面を占めています。 したがって、Rpn2CtdのC末端に付加されたUb単量体を有する融合タンパク質は、突出して、Rpn13Ntdとk48-diUbの遠位Ubとの間の相互作用を妨害し得る（図 5d）。 本発明者らが示したように、２ ０ ０ｎＭのＲｐｎ１ ３Ｎｔｄの添加は、１ ５ ０ｐＭのフルオロフォア標識Ｋ４ ８−ＤＩＵＢの高ＦＲＥＴ種の個体群を〜６ ３％に増加させる（図１ ０Ａ）。 Ｕ Ｂ単量体の添加は、Ｒｐｎ１ ３Ｎｔｄ結合に対して競合することができない（図１Ｆ）。 2c、d）。 本発明者らが、さらに１ ５ ０ｐＭの非標識Ｒｐｎ２Ｃｔｄ−Ｕ Ｂ融合タンパク質を添加した場合、高ＦＲＥＴ種の個体群は、約４％〜約５ ９％減少する（図１ ０Ａ）。 5e）。 一方、本発明者らは、２ ０ ０ｎＭの全長Ｒｐｎ１ ３の添加が、１ ５ ０ｐＭのフルオロフォア標識Ｋ４ ８−ＤＩＵＢの高ＦＲＥＴ種の個体群を〜６ ０％に増加させることを示した（図４Ａ）。 1c）。 150pMの非標識Rpn2Ctd-Ub融合タンパク質のさらなる添加は、高フレット種の個体数を〜4.5〜〜55.5％減少させる（図10B）。 5階）。 なお、Ｒｐｎ２ＣｔｄにＵｂを付加することは、Ｒｐｎ２ＣｔｄとＲｐｎ１ ３Ｎｔｄとの間の相互作用にはほとんど影響しない（補足図）。 S13）。 したがって、我々のデータは、Rpn2とRpn13Ntd上のK48-diUb結合インターフェイスが互いに近いことを示しています。 さらに重要なことに、Ｒｐｎ２−アンカー Ｕ Ｂは、遠位ＤＩＵＢのＲｐｎ１ ３へのアクセスを物理的に遮断し、Ｋ４ ８−ＤＩＵＢとＲｐｎ１ ３との間の相互作用を弱めることができる。
