全膝置換に対する不耐性反応を有する患者：アレルギー診断、人工周囲組織学、およびインプラント周囲サイトカイン発現パターンの組み合わせ評価

Abstract

膝関節置換術（TKR）に対するアレルギーの疑いを特定するための組み合わせアプローチを行った：パッチテスト（PT）、リンパ球形質転換テスト（LTT）、組織病理学（全体的なグレーディング; びｂリンパ球、マクロファージ、および好中球）、および半定量的リアルタイムＰＣＲベースの人工周囲炎症メディエーター分析（Ｉｆｎ Γ、Ｔｎｆ Α、ＩＬ１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１ ０、ＩＬ１ ７、およ 我々は、痛み、滲出液、および運動の範囲の減少のようなまだ原因不明の合併症を持つ25TKR患者を分析しました。 彼らは、証明された金属感作を有する20人の患者（PT反応を有する11人、LTT反応のみを有する9人）で構成されていた。 対照標本は、金属感作のない5複雑なTKR患者、関節形成術前の12OA患者、および関節形成術のない8PT患者からであった。 リンパ球浸潤が見られ、線維性（IV型膜）組織応答は、PT陽性患者の81％で、例えば、金属感受性患者で最も頻繁であった。 後者はまた、periprosthetic IFNy発現をマークしていた。 8月9日、Tiコーティング/オキシニウムベースのインプラントを用いた改訂手術を受けた患者は、症状の軽減を報告した。 我々の知見は、病理組織学と人工周囲サイトカイン評価とアレルギー診断を組み合わせることは、より良い診断戦略を設計することができることを示

1. はじめに

股関節および膝関節置換術は、変形性関節症患者の生活の質を回復するための非常に成功した外科的処置であり、それに対応して移植率 しかし、そのような患者の実質的な部分では、インプラントの失敗はインプラントの改訂につながる。 最近のレビューでは、ドイツでは9.5％、米国では8.4％の総膝関節置換術（TKR）の改訂率が2011年に一覧表示されています。 TKRの失敗の不利な反作用をもたらす条件のスペクトルの中では見つけるかもしれませんがアレルギーの役割はまだ論争の的になる問題です。 皮膚の金属アレルギーは一般集団で頻繁に、例えば、ニッケル（Ni）へのおよそ13%、コバルト（Co）への2%、およびクロム（Cr）への1%です。 摩耗か腐食は関節形成の患者のperiインプラントおよび全身の金属（特にNi、Cr、またはCo）露出をもたらし、それに応じて、失敗したインプラントを持つ患者の金属の感受性の有病率は高められるために報告されます。 人工股関節全置換については，無菌緩みは主に基礎となるメカニズムとしての異物応答を支配したマクロファージを着用することに起因していた。 最後の十年にわたって、注意はperiインプラント発火におけるhypersensitivityの役割に回った。 特に金属上金属関節置換術では，インプラント障害の潜在的エリシターとしてむしろインプラント周囲リンパ球性炎症を示す患者のサブグループが記載された。 記載された組織学的変化には、リンパ球および少数のマクロファージの浸潤、高い内皮細静脈、および部分的な組織壊死のようなびまん性、血管周囲またはリンパ卵胞（リンパ様）が含まれる。 金属アレルギーは，インプラント周囲リンパ球炎症，金属に対するパッチテスト反応性，および金属に対するリンパ球形質転換試験（ＬＴＴ）応答の増強との間の連鎖によって寄与因子として示唆された。 しかし、金属アレルギーが股関節形成術における”傘用語”の有害反応にどの程度寄与するかについては、依然として論争の的になっている議論がある。 実際には、金属アレルギーの患者はよくインプラントを含むそれぞれの金属を許容することができます。 TKRについては、合併症に関連して発見された皮膚金属アレルギーに関する報告もあるが、そのような金属アレルギーが生物学的反応に関与しているかど 特別外来でインプラント不耐性反応が疑われる患者を見ているので，複雑なＴＫＲを有する一連の患者において，潜在的な金属感受性が特定のインプラント周囲組織学的画像およびサイトカイン発現パターンに関連しているかどうかを疑問に思った。 調査結果の潜在的な臨床的関連性に対処するために、我々はさらに、彼らが改訂手術時に”低刺激性”材料の潜在的な使用に特に注意を払って改訂手術からいく

したがって、調査の目的は、異なる診断ステップを組み合わせ、フォローアップにおける所見の臨床的関連性を評価することにより、複雑なTKRにおけるア

2. 材料および方法

2.1. 患者と対照

合計45人の患者がこの研究に参加した。 この研究は倫理委員会によって承認された。 以下の患者群を分析した。

25人工膝関節置換術患者（16m、9f、37-75歳）CoCrMoベースのTKRと緩み、再発性滲出液、痛みなどの合併症は、以前の診断では、malpositioning/malalignment、骨折、または感染のような問題エリシターの兆候がなかったため、整形外科医によってアレルギー診断のために外来に提示された。 アレルギー診断結果によると、これらの患者はさらに三つのグループに割り当てられた。 グループI: 11人の患者（パッチテスト陽性およびLTT陽性）、グループII：9人の患者（パッチテスト陰性およびLTT陽性）、およびグループIII：5人の患者（パッチテスト陰性およびLTT陰性）。

この研究には、インプラントを持たない12人の患者（1m、52〜89歳、「OA対照群」）が含まれていたが、膝関節置換術前の変性関節疾患/変形性関節症（OA）が含まれていた。

この研究には、インプラントを持たないが、アレルギー性皮膚疾患の疑いのあるパッチテスト（PT）を受けた8人の患者（2m、53-75歳、”PT対照群”）が含まれていた。 6/8はNi-PT反応性を有し、2/8はNi-PT反応性を有していなかった。

25人のTKR患者で、潜在的な金属感受性をPTおよびLTTによって評価し、さらに組織学、分子分析、および微生物学のために人工周囲組織サンプルを得た。 さらに，外来訪問時にＷＯＭＡＣスコアを得て，患者の日常生活活動ととう痛の知覚についてフィードバックした。 １ ２人のＯＡ患者（「ＯＡ対照群」）において、一次ＴＫＲ組織試料で、組織学、分子分析、および微生物学のために得られた。 ８つの「ＰＴ対照群」患者において、組織学および分子分析のために、６つのＮｉ−ＰＴ反応性および２つのＮｉ−非反応性ＰＴ領域から生検を得た。 45人の患者の特徴を表1に要約する。

2.2. パッチテスト（PT）

25人のTKR患者において、co、Cr、およびNi製剤（Hermal、Reinbek、Germany）を含む30種類の接触アレルゲンの欧州標準シリーズに、金属アレルゲンシリーズ（Brial Allergen GmbH、Greven、Germany）、ならびにセメント関節置換術の場合の骨セメント成分シリーズを加えたものを患者の背中で試験した。 試験調製物をＦｉｎｎチャンバーに２日間適用し、反応を除去の日および適用後３日に評価した。 骨セメントシリーズ試験を有する患者では、1週間後に追加の読書を行った。 皮膚反応の等級付けは、ドイツの接触皮膚炎研究グループによって推奨されたとおりであった。

2.3. リンパ球形質転換試験（ＬＴＴ）＜１ ６ ９ ５＞＜３ ２ ６ ３＞末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｄｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上での密度遠心分離により、ＴＫＲ患者のヘパリン化血液から得た。 細胞を、自己血清、グルタミン、抗生物質−抗真菌−溶液、および非必須アミノ酸によって補充されたＲＰＭＩ１ ６ ４ ０培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で培養した。 全ての培養は、９ ６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で４倍に実施した。 刺激は、pan T細胞マイトジェンフィトヘマグルチニン（PHA）2.4μ g/mL、破傷風トキソイド（TT）5μ g/mL、Niso4、Crcl3、およびCocl2（それぞれ7濃度からto）および対照として培養培地単独であった。 ５日後、細胞を、３Ｈチミジンで一晩パルスし、増殖を、組み込まれた放射能によって評価した。 刺激指数（Ｓ ｉ）は、刺激された培養物に対する刺激された培養物の毎分平均カウント（ｃｐｍ）の比によって計算された。 SI>3は陽性と考えられた。

2.4. インプラント周囲組織の分析

25人のTKR患者において、組織標本は、改訂時に新たに形成された関節嚢から得られた。 微生物学的評価のために少なくとも2つのプローブをEndoklinik Hamburgに送った。 他の二つのプローブは組織学のために処理され、一つのプローブは分子分析のために処理された。 12人のOA患者の組織標本では、上記のように組織学および分子分析のための一次関節形成術移植の瞬間に得られた。 8″PTコントロールグループ”患者は、D3のテスト読み取り後、背中に彼らのNi-PT領域のパンチ生検を受けました。 組織学および分子分析のために一つのプローブをそれぞれ得た。

2.5. 組織学的検査

ホルマリン固定組織を処理し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。 免疫組織学は、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ２ ０）、マクロファージ（ＣＤ６ ８ｒｅｓｐ ｋｐ１）、および好中球（ＣＤ１ ５）抗原に対する抗体を用いて行った。 切片を顕微鏡的に調べ，マクロファージ，ｔリンパ球またはｂリンパ球のびまん性または血管周囲蓄積および形質細胞を含む組織成分の比例分布および組織標本の全体的な反応パターンを半定量的に評価した。 採点スコアはKrenn et al. また，ＴＫＲ患者由来試料の場合にはコンセンサス分類を用いた。 このコンセンサス分類は、インプラント周囲組織反応パターンを、粒子支配異物のような応答（I型）、顆粒球支配感染型（II型）、I型とII型の混合物（複合型、III型）、およびpaucicellularとむしろ線維性反応（IV型、無関心な型）に細分する。

2.6. 分子分析

次のプローブは、その後の分析のためにRNA保存液中で得られた：25TKR患者と12OAコントロール患者のそれぞれからインプラント周囲および皮下組織（; パッチテスト対照群から6つのNi-PT陽性プローブおよびNi-非反応性試験部位から2つのプローブ（参考）。

全RNAは、フェノール/クロロホルム抽出によって組織標本から単離され、AMV逆転写酵素を用いてcDNAに逆転写された。 以下のサイトカインの発現を、ライトサイクラー中の半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した：Ｉｆｎ Γ、ＴＮＦ、ＩＬ１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１ ０、ＩＬ１ ７、およびＴｇｆ Β。 発現値は、SchmittgenおよびLivakによるΔ Δ Ct法により、ハウスキープ遺伝子EF1-と比較して決定した。

2.7. 術前および術後のＷＯＭＡＣスコアの比較＜１ ６ ９ ５＞＜３ ２ ６ ３＞修正されたスコアシステムは、Ｒｏｏｓらの出版物に従って使用されている。 . グループIおよびII患者から術前WOMAC膝スコアが利用可能であったので、我々はさらに、（手術後6ヶ月以上で）彼らの術後WOMACスコア情報を得るために改訂手術後 特に、”低刺激性”材料を使用して改訂された患者に焦点を当てた。

3. 結果と考察

金属インプラントアレルギーは依然として除外の診断のままであり、疾患固有の基準が欠落しており、異なる診断ステップを組み合わせる必要があるため、診断が遅れている。 したがって，ＴＫＲ障害ではまず種々の合併症エリシターが疑問視され，ＰＴ，ＬＴＴ，および病理組織学の組み合わせによって金属インプラントアレルギーが診断される。 ここで提示された研究は、診断ツールの改善を支援することを目的としています。

3.1. アレルギー診断

金属感受性を有する20人の患者のうち、11人（グループI）は金属に対するPT反応（一部は複数の反応）を示した：10人はNi、6人はCo、2人はCr、これらの11人の患者のうちの1人は骨セメント成分（ゲンタマイシンおよび過酸化ベンゾイル）に対するPT反応も示した。 6月11日には追加のLTTデータが利用可能であり、5倍のNi反応性と1つの非反応性LTTを示した。 残りの9人の患者（グループII）では、PTが陰性であるがLTTが陽性であり、Niに対する9x LTT反応性、Coに対する1xが見出された。 これらのデータは表2-4に要約されています。 いくつかの研究では、関節置換術を有する患者において金属感受性の増加が見出されている。 より大きなスケールでは、100の無症状と200の複雑な関節置換術患者を比較すると、金属アレルギーのそのような増加した発生率、特にNiを再現することがで 生体内の金属放出条件に関するほとんどのデータは、股関節形成術患者に由来する。 しかし、局所的なCoおよびCr放出はTKRにおいても見られ、患者のそれぞれの全身暴露が報告されている。 さらに，Ｃｏｃｒｍｏ-関節形成術患者では実質的なＮｉ放出も観察される可能性がある。 患者群におけるＮ ｉアレルギーの優位性は，一般集団におけるＮ ｉアレルギーの相対的優位性を反映しているだけではないと考えられた。 一方，人工膝関節置換術をうまく行っている無症状の患者でも，インプラント合金金属に対する皮膚金属アレルギーがある可能性がある。 従って、Ｇｒａｎｃｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ． 2012年には、金属感受性の存在は、単一の患者レベルでのインプラント障害メカニズムを意味しない可能性があると述べた。

3.2. 組織学的検査

我々は次に、人工周囲組織分析が過剰作動性組織応答を識別するのに役立つかどうか疑問に思った。 この目的のために、四つの条件は、組織標本の比較分析のために選択されました。 例えば、人工関節周囲組織サンプルは、（1）合併症および金属感受性を有する20人のTKR患者（グループIおよびII）、（2）合併症を有する5人のTKR患者（グループIII）、（3）原発性関節置換術における変性性膝関節疾患/変形性関節症（OA対照群）を有する12人の患者から得られた。; また、(4)8PT患者（PT対照群）におけるPT部位で行われた皮膚生検では、6はniに対する湿疹性PT反応が陽性であり、2はNiに対するPT反応がなかった。 人工周囲／（ｎｅｏ）カプセル組織応答の評価は、Ｍｏｒａｗｉｅｔｚらによって最初に公表された標準化されたコンセンサス分類に従って行われた。 2006年、Krennらによって改訂された。 . さらに、Tリンパ球、Bリンパ球、好中球、およびマクロファージの存在に焦点を当て、さらにグループI、II、およびIII患者のプローブも微生物学評価に送られた。 いくつかの予期しない所見がなされた：グループIの9/11患者とグループIIの6/9患者は、人工周囲組織反応に似たコラーゲン繊維豊富な結合組織（IV型/不確定型）を有していた。 そして、わずか5の20金属感受性患者は、マクロファージ支配応答と”摩耗粒子誘発型”の全体像を持っていました。 これは、失敗した関節形成術における組織パターンのような主に摩耗粒子/異物応答の一般的な観察と、Morawietz et al.によって分析された370サンプルにおける唯一の15％のIV型（線維性）応答反応性とは対照的である。 . 私たちのグループIおよびII患者のこれらの20のサンプルに感染の兆候はなかった。 優勢な”関節線維症”様の細胞性反応性であるにもかかわらず、リンパ球の存在は血管周囲または散在した分布に認められた（図1（a）および1（b））。 対照的に、金属感受性のない5人の患者のうち、二つは感染を示し、リンパ球性炎症は、これらの患者のいずれかでのみ見られた。 OA患者では、再び、リンパ組織球浸潤が好中球の不在とともに認められた。 これらの知見は、表２、３、および４に要約される。 図1(a)および図1(b)は、I群およびII群の患者の代表的な組織学的所見である。Ni誘発性アレルギー性パッチテスト反応からの生検は、代表的なサンプルに示すように、接触アレルギー典型的な表皮変化とともに、血管周囲および時にはびまん性リンパ組織球浸潤を特徴とした(図2(a))。 Witzlebら。 人工周囲組織における（T-）リンパ球の血管周囲またはびまん性の存在は、高作動性応答として解釈することができると推測された。 しかし、von Domarusらは、tリンパ球浸潤を、無菌的に緩められた金属オンポリエチレン関節形成術の組織サンプルにおける一般的な所見として説明した。 これらの結果から，ｎｅｃｒｏｂｉｏｓｉｓもｔリンパ球の浸潤も金属過敏反応に特異的ではないと考えられると結論した。

(a)
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(b)

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フィギュア1

(a）血管周囲リンパ球浸潤の例; CD3ステイン。 （ｂ）散乱した人工周囲リンパ球の例；ＣＤ３染色。

3.3. サイトカイン発現プロファイル

部分的に決定的な出版物を考慮して、我々は次の炎症メディエーター発現の評価は、組織応答パターンの特性を改善するこ 図2(b)には、Niに対する急性進行中の特定の皮膚遅延型過敏症反応のサイトカインRNA発現パターンが示されている。 主な所見は、細胞免疫応答を刺激するTh1応答の典型的なマーカーとしてのIFNyのマークアップレギュレーションと、T細胞の活性化および増殖を示すIL-2の 金属感受性およびOA対照群の有無にかかわらず、金属TKR患者の群を評価する場合、IFNyのそのようなアップレギュレーションは、I群患者、例えば合併症を伴うTKRおよび金属に対するパッチテスト反応性においても特に目に見えた。 評価された他のメディエーターのうち、TKR患者でIL-2発現は、グループIとOA患者群でより顕著であった-とTGF-γ発現は、グループIとIIでわずかに多く。 これらの他のメディエーターは、OA患者においてTNFのいくつかの個々の増加のみがあったが、異なる群間に大きな差はなかったので示されていない。 増加したTH1系統コミットメントは、増加したIFNy発現によって反映される。 ここでは、典型的にはNi誘発PT反応ではなく、特にグループI TKR患者では、人工周囲疾患の進行におけるその役割を示唆しているだけでなく、マークされたIFNy 興味深いことに、Jämsenらは最近、無菌的に弛緩した人工股関節置換術の界面組織に散在するCD3+T細胞を発見し、マクロファージ関連の摩耗粒子応答が優勢であることを報告した。 しかし、定量的PCRによっても免疫組織化学によっても、それらは有意なTH1（すなわち、IFNy）またはTH2（IL-4）メディエーター発現を示すことができなかった。 離れてIL-6から特にTGF-γは、人工関節周囲、関節線維症の発症と持続性に中心的な役割を果たしているかもしれないので、我々はここでは、異なる組織サン 金属感受性ＴＫＲ患者におけるｔｇｆ-γ発現の増加を観察した。 図3(a)-3(c)は、これらの知見をまとめたものである。

(a))

(b))

(c)
(c))

(a)
(b)(c)
(c)
(b)(c)
(c)
(c))

フィギュア3

(a)5つの異なる患者群の組織におけるIFNyのサイトカイン発現;サイトカイン発現は、Δ Δ Ct法によってハウスキーピング遺伝子EF-1および患者対照組織と比較して分析された;(Wilcoxon-Mann-Whitney-test DONE by SPSS statistical software)。 （ｂ）５つの異なる患者群の組織におけるＩＬ−２のサイトカイン発現；サイトカイン発現を、ハウスキープ遺伝子Ｅ Ｆ−１および患者対照組織と比較してΔ Δ Ｃｔ−法によ （ｃ）５つの異なる患者群の組織におけるＴｇｆ Βのサイトカイン発現；サイトカイン発現を、Δ Δ Ｃｔ法（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−ｔｅｓｔ）により、ハウスキープ遺伝子Ｅ Ｆ−１および患者対照組織と

3.4. 前および術後WOMACスコアの比較

19 20TKR患者の私たちの要求に応答し、術後WOMACスコアリングを完了しました。 9人の患者は、改訂時に”低刺激性”のTKRが移植されたことを報告した（8x Tiベースの表面コーティング、1x oxiniumベースのインプラント）。 8/9患者は、図4に示すように、このアプローチから利益を得ました。 これまでのところ、”低刺激性”TKRの使用による潜在的な利益に関する症例報告または小規模な患者シリーズのみが存在する。 しかし、これらの結果は、より大規模なフォローアップ研究の必要性を強調している。

フィギュア4

“低刺激性”材料（8xチタニウム、1x oxinium）を受け取った9人の患者の修正外科の前後のWOMACのスコア。 スコアシステムは、Ｒｏｏｓらの出版物に従って使用されている。 .

しかし、研究には限界があります: 人工周囲組織サンプルは動的プロセスの実際の段階のみを反映している可能性があり、OA患者はうまく機能しているインプラントおよびこの調査 従ってそれ以上の調査は金属のインプラントアレルギーのmultimodular診断アプローチを認可するために必要です。

4. 結論

この研究は、金属インプラントアレルギーの診断特性を開発するためのアプローチを提供するために組み合わせた分析ステップを利用する可能性 アレルギー診断（PTおよびLTT）および人工周囲組織学は、インプラント合金金属に対する免疫学的応答を指し、炎症メディエーター発現のパターンは機能的分化に加

予期せぬ所見は、金属感作TKR患者における優勢な”線維性”IV型界面応答およびPT陽性tkr患者における顕著なIFNy発現であった。

利益相反

著者らは、この論文の出版に関して利益相反はないと宣言している。

謝辞

この研究は、ハンブルクのEndo-Stiftungの助成金、およびB Braun-Aesculap、TuttlingenおよびLudwig-Maximilians-University Of Munichの助成金によって支援されました。