高忠実度&高忠実度PCR酵素:KOD DNAポリメラーゼ
高熱好性古細菌Thermococcus kodakaraensis KOD1(旧Pyrococcus kodakaraensis KOD1)(図1) 図1)は、ソルファタリック温泉から単離された(図1)。 2）コダカラ島で（図。 3)日本では、識別され、特徴付けられました。
このKOD1株にはファミリー B DNAポリメラーゼ(KOD DNAポリメラーゼ)が見出され、様々なユニークな特性を示している(1)。
-
図1.1.1. 1. テルモコッカス-コダカラエンシス-コダカラエンシス
-
図1.1.1. 2. ソルファタラ（コダカラ島、日本)
-
図1.1.1. 3. コダカラ島（鹿児島県）)
KOD DNAポリメラーゼは強い3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（証拠読み取り活性）を示し、Taq DNAポリメラーゼに欠けている活性を示す。
また、この酵素は、Pyrococcus furiosus（Pfu DNAポリメラーゼ）からのそれよりも五倍高い伸長速度（100-130ヌクレオチド/秒）と10-15倍高いプロセッシング性（>300塩基）を示す、優れた この酵素の伸長速度は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの伸長速度の約２倍である（表１）（図１）。 4) (1).
表1. 熱安定性DNAポリメラーゼの特性
| Proterty | 示されたDNAポリメラーゼの値 | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNAポリメラーゼ | Pfu DNAポリメラーゼ | Taq DNAポリメラーゼ | |
| 起源 | 古細菌 | 古細菌 | 細菌 |
| 推定された分子量（kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| 最適温度（º C) | 75 | 75 | 75 |
| 75º Cの最適pH | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| 熱安定性（半減期） | 95º C、12h;100oc、3.0h | 95º C、6h;100º C、2.9h | 95º C、1。6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. KOD PfuとTaq DNAポリメラーゼの伸長速度の比較。
m13ssDNAを鋳型として75℃で合成したDNAの長さに応じて伸長速度を測定した。
KOD DNAポリメラーゼの活性の研究と並行して、ポリメラーゼの中和抗体と校正活性を開発した(2)。 これらの抗体は、KOD DNAポリメラーゼを用いた”ホットスタートPCR技術”に適用することができます。
DNAポリメラーゼの3次元構造は2003年に特徴付けられた（図。 5) (3).
図1.1.1. 5. KOD DNAポリメラーゼの3次元構造
J.Mol. バイオル, 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus-（コードNo. KOD-201）は、KOD DNAポリメラーゼに基づいて開発され、高いPCR忠実度を示す（表2）。
表2. 各PCR酵素の変異頻度の比較。
| 配列された総塩基 | 変異塩基の数 | 変異頻度（x10-5) | |
|---|---|---|---|
| コッドプラス- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| 小豆島 | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNAポリメラーゼ | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-塩基長-PCR酵素 | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNAポリメラーゼ | 102,708 | 145 | 141.2 |
忠実度は、ＰＣＲ産物を配列決定することによって突然変異頻度として測定した。 PCR産物（ヒトβ-グロビン領域の2.4kb）をクローニングした後、約96クローンが選択され、配列決定された。
KOD FX(コードNo. KFX-101)はKOD DNAポリメラーゼに基づいて開発され、KODプラスより大いに大きいPCRの成功率を示します(効率および延長の機能に基づいて)(コードいいえ。 ＫＯＤ−２ ０ １）または他のＴａｑベースのＰＣＲ酵素。 ＫＯＤ Ｆ Ｘは、粗試料（例えば、マウス尾溶解物、培養細胞）からの増幅にも有効である。
図1.1.1. 6. 粗マウス尾ライセートからの直接増幅
1,2:KOD FX
3~6:他社酵素
M:マーカー
