Frontiers in Genetics

Introduction

L1細胞接着分子遺伝子(L1CAM)は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する神経細胞接着分子であり、神経系の発達に重要な機能を持っている(伊藤-伏木,2015)。 L1CAMの変異は、L1疾患として要約されているXリンク神経学的症候群に関連している。 それらは次のように分類されます: Sylviusの水道管の狭窄（HSAS）によるX連鎖水頭症（XLH）、MASA症候群（知的障害、失語症、シャッフリング歩行、内転親指）、痙性麻痺1型（SP1）、脳梁のX連鎖無形成（ACC）（Weller and Gartner、2001;Itoh and Fushiki、2015）。

HGMD®Professional2019.2(https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/all.php)では、L1CAM遺伝子における約282の疾患原因変異(DMs)が報告されています。 L1CAM遺伝子の変化は様々である; 282人の患者からの変異データ解析は、51％のミスセンスとナンセンス変異、25％の欠失、5％の挿入、および19％のスプライス部位の変化を開示するが、病原性の可能性を持つL1CAMのサイレント変異はまれであり、サイレント変異は、多くの場合、特に全エキソームシーケンシング（WES）検出で無視された。

本研究では、WESを用いて、胎児水頭症との連続妊娠を報告している中国の妊婦の胎児DNAをスクリーニングし、L1CAM遺伝子に新しいサイレント変異c.453G>T（p.Gly151=）のみを発見した。 興味深いことに、さらなる分析を通じて、我々はサイレント変異が潜在的な5’エクソン5とL1CAMタンパク質の24アミノ酸から72bpのインフレーム欠

症例発表

他の病院で胎児水頭症による妊娠の自発的な終了後、28歳の健康な女性が当院に紹介されました。 すべての胎児は男性であった。 私たちの病院（中国浙江省浙江大学医学部女子病院）に到着したとき、彼女は妊娠24週ですでに五番目の妊娠にあり、画像検査で胎児の水頭症を患っていた。 遺伝的原因を探索するために、胎児の血液サンプリングは、妊娠26週で行われました。 従来の細胞遺伝学的研究は胎児および親試料の両方に対して行われ、胎児試料はさらに一塩基多型（ＳＮＰ）アレイおよびＷＥＳによって分析された。

本研究は浙江大学医学部女子病院倫理委員会の勧告に従って実施され、ヘルシンキ宣言に従って本研究のすべての参加者からインフォームドコンセントを取得した。 この研究プロトコルは、中国の浙江大学医学部女子病院の審査委員会によって承認されました。

材料および方法

核型およびSNPアレイ

胎児臍帯血および末梢臍帯血の核型は、コルヒチンによって中期に逮捕された少なくとも30の血液リンパ球の従来の核型によって決定された。 培養細胞のGバンディング核型は、320-400バンドレベルで約10Mbの解像度で行われました。 ＳＮＰアレイは、Ｃｙｔｏｓｃａｎ（商標）Ｈ Ｄ ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）によって製造業者の指示に従って実施され、７ ５ ０，０ ０ ０のＳＮＰプローブおよび１，９ ０ ０，０ ０ ０の非多型プローブを含む約２，６ ０ ０，０ ０ ０のマーカーで、包括的な全ゲノムカバレッジのために実施された。 データは、Ｇｒｃｈ３ ７／ｈｇ１ ９アセンブリに基づいて、染色体分析スイート（Ｃｈａｓ）ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃ Ａ）によって分析した。 コピー数の結果のレポートしきい値は、500kbに設定され、マーカー数は利益の場合は≥50、損失の場合はmarker50、200kbに設定されました。

Whole-Exome Sequencing

Wesの主要部分はBeijing Genomics Instituteによって提供されました。 ゲノムＤＮＡを、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃ Ａ）によって抽出し、次いで、ｃｏｖａｒｉｓ ＬＥ２ ２ ０（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）によって断片化して、対末端ライブラリー（２ ０ ０〜２ ５ ０ｂｐ）を生成した。 全ての増幅されたライブラリーを、ＢＧＩＥＡＳＹ−５ ０ ０プラットフォーム上で実施し、一本鎖ＤＮＡをＭｇｉｅａｓｙ（商標）ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ Ｖ１（ＢＧＩ、Ｓｈｅｎｓｅｎ、Ｃｈｉｎａ）と混合し、次いで、ＢＧＩＥＡＳＹ−５ ０ ０ＲＳ ｈ ｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｇｉ、Ｓｈｅｎｓｅｎ、Ｃｈｉｎａ）と１ ０ ０ＳＲ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用し

標的配列決定およびフィルタリングから得られたクリーンリード（長さ90bp）を、Burrows-Wheeler Aligner（BWA）マルチビジョンソフトウェアパッケージ（Li and Durbin、2009）を使用してヒトゲノムリファレンス（hg19）に整列させた。 アライメント後、出力ファイルを使用して、標的領域、一塩基変異体（Ｓｎｖ）、およびｉｎｄｅｌ呼び出しの配列決定カバレッジおよび深さ分析を実行し、Ｓｎｖおよびｉｎｄｅｌを検、2010）、すべてのSnvおよびindelsは、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）一塩基多型データベース（dbSNP）、HapMap、1000ゲノムプロジェクトデータセット、および100人の中国の健康な成人のデータベースを含む複数のデータベースを介してフィルタリングされ、推定された。 Condel、SIFT、PolyPhen-2、LRT、Mutation Taster、およびPhyloPを使用して、変異体の効果を予測しました。 病原性変異体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏ ｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＡＣＭＧ）によって発行されたプロトコールの下で評価される（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2015). ヒト遺伝子変異データベース（HGMD）は、変異をスクリーニングするために使用されました。 すべての潜在的な病原性変異体は、サンガー配列決定法を用いて検証した。

RNA抽出、PCR、および配列決定

末梢血単核細胞（Pmbc）および臍帯血単核細胞（CBMCs）は、Ficoll密度勾配分離によって単離された。 Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ＰｍｂｃおよびＣｂｍｃから全ＲＮＡを抽出した。 抽出した全Ｒｎａを、ＲＴキット（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写した。 ＰＣＲは、Ｇｏｌｄｓｔａｒ Ｂｅｓｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＣＷＢＩＯ，Ｂｅｉｋｉｎｇ）を用いて行った。 プライマー配列は、ｌ１ＣＡＭ−ＤＮＡ−５Ｆ、ＣＣＣＡＣＣＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡ、Ｌ１ＣＡＭ−ＤＮＡ−５Ｒ、ＣＧＣＴＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＴである。; L1CAM-mRNA-4-6-Ｆ、ＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＡ、およびＬ１ＣＡＭ−ｍＲＮＡ-4-6-R、GCGGCTTCCTGTCAATCA。 Ｓａｎｇｅｒ配列決定は、ＡＢＩ３ １ ３ ０ＤＮＡ分析装置によって行った。

結果

28歳の健康な女性が、胎児の水頭症による妊娠の自発的な終了後、当クリニックに紹介されました。 すべての胎児は男性であった（図1A）。 家族性血統はＸＬＨを示していたと考えられた。 彼女は妊娠26週でここに第五の妊娠にすでにあった。 胎児超音波スキャンとＭＲＩにより胎児脳室腫大が検出され，水頭症の存在が一貫して示された。 彼らは両側脳室と第三脳室が明らかに拡張しており、脳梁の脳内および無形成に重度の水頭症があったことを示した（図1B）。

考えられる遺伝的原因を探るために、胎児の採血を分析するために核型解析とSNPアレイを行い、陽性所見は認められなかった。 脈絡膜血管新生（CNV）の結果はGene Expression Omnibus（GEO）に寄託されており、アクセッション番号はgse133063であり、以下に添付されている（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE133063）。

その後、ウェスによって胎児を検出した。 可能性の高い病原性変異体同定を見つけるための分析戦略を図S1に示した。 変異体のリスト（表Ｓ１）は、変異体頻度、変異状態、および継承モードのスクリーニングによって得られた。 水頭症関連遺伝子（ＨＰ：０ ０ ０ ０ ２ ３ ８、＜１ ０ ４ ５＞）（表Ｓ２）を考慮に入れると、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子（ＮＭ＿０ ０ ０ ４ ２ ５．３）のエクソン５中のｃ．４ ５ ３Ｇ＜８ ９ １ ７＞Ｔの無声変異を除いて、さらなる顕著な変異はなかった。 c.453G>TはHGMDおよびClinVarでは報告されず、dbSNP、gnomAD、およびその他のデータセットでは発見されなかった。 ＡＣＭＧの基準およびガイドラインによれば（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅ ｔ ａ ｌ．,2015),それはまだ”病原性”または”可能性が高い病原性”の基準に達していませんでした,しかし、他の潜在的な変異はありませんでした;我々は発見された静かな変異のさらなる分析を行うしかありませんでした.

伝統的な考え方によれば、この塩基置換はグリシンをコードするコドン151の第三塩基で起こり、それによって中性変異（p.Gly151=）を生成する。 この変異体は、サンガー配列決定によって夫婦の胎児臍帯血および末梢血から抽出されたDNA中で確認された（図1C）。 女性はヘテロ接合変異を持ち、彼女の夫は野生型の遺伝子型であった。

変異テイスター(http://www.mutationtaster.org/)を用いて、c.453G>Tを”病気の原因となっている。「タンパク質の特徴が影響を受け、スプライス部位が変化する可能性があることを示しました。この静かな突然変異におけるL1CAM機能の潜在的なスプライシング効果について興味がありました。 サイレント変異は、以下のオンラインソフトウェア製品を用いて試験した：Ｎｅｔｇｅｎｅ２（＜２ ８ ７ ９＞）およびＮｎｓｐｌｉｃｅ（＜９ ６ ５ ２＞）；５’電位スプライス部位も、Ｌ１ＣＡＭ ｃ中に生成される453G>T変異は、ソフトウェア製品を使用しています(図S2)。 結果は、このサイレント変異は、通常のエクソン6/イントロン6スプライス部位から上流の潜在的な5’スプライス部位72bpを作成したことを示した（図2A）。 この場合、L1CAMメッセンジャー RNA(mRNA)の長さの変化をI:2とII:5の間で見つけることができます(図2A)。 RT-PCRは、L1CAM mRNA中のエクソン4-6を増幅するように設計されたプライマーを用いて行った。 実際、結果は、胎児ｃＤＮＡ ＰＣＲにおいて短いバンドの切断を示した（ＩＩ：５）が、Ｌ１ＣＡＭ ｍＲＮＡから増幅されたバンドは、夫ｃＤＮＡ ＰＣＲにおいて予想される長いバンドを含んでいた（ｉ）。:1)および妊婦cDNA PCRにおける長/短バンド(I:2)(図2B)。 増幅された断片の直接配列決定は、欠失が男性胎児cDNAにおけるエクソン5の最後の72bpを関与させることを示した（女性はキャリアであった）（図2C）。 私たちは重要な病原性の証拠を得ました。

この無音変異により、L1CAMタンパク質の24アミノ酸（残基151-174）が生じ、Lys(K)はコドン175でGlu(E)に置換された（図2A）。 いくつかの種間で複数のL1CAMタンパク質配列のアライメントと哺乳類全体でL1CAMの不足しているアミノ酸の保全がありました: Homo sapiens、Pan troglodytes、Bos taurus、Mus musculus、およびrattus norvegicus（図3A）。 野生型およびc.453G>Tスプライシング変異L1CAMタンパク質は、ソフトウェアCPHmodels-3.2サーバー（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）によって予測された（図3B）。 免疫グロブリン様（Ig様）ドメイン2（残基134-230）の野生型およびスプライシング変異L1CAMタンパク質を図3Cに示す。L1CAM c.453G>Tスプライシング変異3

ディスカッション

サイレント変異は、多くの場合、WESによって検出されたが、不十分な注意が払われており、DMsの省略につながっています。 本研究では、我々は水頭症を持つ中国の家族の遺伝的原因を探索するためにWESを採用したが、L1CAMで新しいサイレント変異を発見しただけであり、さら 幸いなことに、我々は、サイレント変異が新しい5’スプライスサイトを作成し、DMであったことを証明した。

L1CAMの変異はX連鎖L1疾患を引き起こす可能性がありますが、臨床症状は様々であり、変異は予期しない表現型を生成します。 この研究では、苦しんでいる5つの胎児はすべて男性であり、これは遺伝パターンと一致しています。 胎児の超音波スキャンおよびMRIは体の脳梁のXLHそして無形成を含む典型的なL1病気を、示します。 これは、L1CAMの遺伝子型–表現型相関に関する我々の理解を向上させます。

L1CAM c.453G>T(P.Gly151=)は、当初、タンパク質配列に影響を与えないと考えられていました。 しかし、L1CAM遺伝子における他の無声変異、c.924C>T（p.Gly308=）およびc.645C>T（P.Gly215=）は、DMsであることが報告されている（Du et al. ら、１ ９ ９ ８；Ｖｏｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2010). C.に所属していた。924C>T変異は、正常なエクソン8/イントロン8ドナーのスプライス部位に69bp5’の新しいスプライス部位の活性化をもたらし、それは水頭症のための”病, 1998). Ｌ１ＣＡＭ中のｃ．６ ４ ５Ｃ＜８ ９ １ ７＞Ｔについては、５ １ｂｐを、新しいエクソン６／イントロン６ドナースプライスの活性化により欠失した（Ｖｏｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2010). C.453G>Tの変異は、潜在的な5’スプライスサイト上流の通常のエクソン5/イントロン5スプライスサイトから作成しました。 これらのすべてのサイレント変異は、エクソンがスキップされ、その結果、新しいドナースプライスサイトを作成しました。 それは、タンパク質のスプライシングに影響を与える可能性のあるこれらの静かな突然変異に細心の注意を払うことを

膜貫通糖タンパク質であり、細胞接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるL1CAMタンパク質は、細胞表面で多くの異なる糖タンパク質と相互作用することができ、ホモ親和性結合がおそらくその主な相互作用様式である（Wei and Ryu、2012）。 ニューロファシンにおけるIg様ドメイン1-4の結晶構造に関する研究は、多くの病理学的L1変異がこれらのドメイン内の保存されたアミノ酸残基に影響を与え、ホモフィリック相互作用を妨害することを示唆した（Liu et al. 2011）、特にIg様ドメイン2の機能研究によって検証されたように（Zhao et al., 1998). 我々の研究では、l1CAM c.453G>Tは、下流のシグナル伝達経路の開始を開始するために失敗し、異常な細胞外相互作用につながる、L1CAMタンパク質の細胞外部 このL1CAM変異体の質量分析に特化したさらなる研究は、細胞内でどのような分子アンサンブルが生成されるかを具体的に明らかにするであろう。

要約すると、WESを通じて、我々は水頭症の原因となる5’スプライス部位を生成するL1CAMの新しいサイレント変異c.453G>Tを報告しました。 この異常なタンパク質変異体は、L1CAMタンパク質ホモ親和性結合に影響を与える可能性があるIg様ドメイン2を変更すると予測された。 さらに，水頭症を伴う五つの連続妊娠を報告している妊婦に対して出生前遺伝子診断を行った。 一方、それはWESで検出されたいくつかのサイレント変異を無視すべきではないことを示唆した;これらの変異のスプライシング予測が必要であった。 これは、水頭症の出生前診断および移植前出生前診断のための新しい遺伝的基礎を提供した。

データの可用性

公に利用可能なデータセットは、この研究で分析されました。 このデータはここにあります：GSE133063（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE133063）。

倫理声明

人間の参加者を含む研究は、中国の浙江大学医学部女子病院の審査委員会によって審査され、承認されました。 この研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントは、参加者の法定後見人/近親者によって提供されました。 書面によるインフォームドコンセントは、この記事に含まれる潜在的に識別可能な画像またはデータの公開のために、個人および未成年者の法定後見人/近親者から得られたものです。

著者の貢献

YS、YLi、MC、YLu、YQ、YYが実験を行った。 YSは数字を準備しました。 ＭＣおよびＹｌｉは、ＷＥＳデータを分析した。 ＹｌｕおよびＹＱは核型解析およびＳＮＰアレイを行った。 YYサンプルを募集しました。 ＨＬとＦＬは画像検査を行った。 YSとMDが原稿を書いた。 すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。

資金調達

本研究は、浙江省の主要研究開発プログラムである中国国家自然科学財団（助成番号81801441）によって支援されました（助成番号81801441）。 2019C03025）、中国の国民の主研究開発プログラム（補助金第2016YFC1000703）、および浙江省の医学の科学研究の基礎（補助金第2014KYA246）。

利益相反声明

著者らは、この研究は利益相反の可能性と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に行われたと宣言している。

謝辞

この研究に登録された患者に感謝します。 私たちは博士に感謝します。 Jiong Gao（BGI Genomics、BGI-Shenzhen、Shenzhen518083、中国）は、この原稿の準備中に彼の援助のために。

補足資料

この記事の補足資料はオンラインで見つけることができます: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2019.00817/full#supplementary-material

図S1/WESによる可能性の高い病原性変異体同定を見つけるための分析戦略。

図Netgene2とNNSpliceによって予測されるS2|ドナースプライスサイト。

表S1|バリアントの頻度、突然変異状態、および継承モードのスクリーニングによるバリアントのリスト。＜３ ６ ４ ０＞＜８ ４ ５ ２＞表Ｓ２／水頭症関連遺伝子のリスト（ＨＰのための輸出：０ ０ ０ ０ ２ ３ ８）。