Tripure Isolation Reagent(Roche)を用いて全RNAを抽出した。＜９ ６ １ ７＞ＲＮＡ試料を、Ｒｎａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅｉで処理し、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。 得られたＲＮＡを、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ除去キット（ヒト／マウス／ラット）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用することによって、リボソームＲＮＡを枯渇させた。 ＲＲＮＡ枯渇ＲＮＡを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、第１鎖ｃ ＤＮＡを合成した。 続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅを用いて第２の鎖を作製した。 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＤＵＴＰ、ＤＣＴＰ、ＤＡＴＰ、およびＤＧＴＰセット（それぞれ１ ０μ ｍｏｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、第２鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れた。 その後、cDNAをCovarisで約300bpに剪断した。 断片化の後、試料をＭｉｎｅｌｕｔｅ ｃｏｌｕｍｓ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。 そして、断片の突出した3’および5’末端は、T4DNAポリメラーゼ（NEB）およびT4DNAポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）t4DNAリガーゼバッファー（NEB）中を用いて修復された。 次に、Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’−＜８ ５ ２ ５＞５’ｅｘｏ−，ＮＥＢ）を緩衝液２（ＮＥＢ）中で使用することにより、Ｄ Ａ末端を生成した。 アダプター結紮反応は、インデックス付きアダプターとクイックリガーゼ（NEB）を使用して設定しました。 生成物をＵｎｇ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）処理およびＰＨＵＳＩＯＮ Ｈｉｇｈ-Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。 ライブラリーを、２％Ｅ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｒｐｕｓ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で可視化した。 バーコード化されたライブラリは、Hiseq2500（Illumina）の単一レーン上で配列決定された。
