Keratocytes

C.Polyacrylamideに蛍光ビーズを埋め込んだ

前節で説明したように、シリコン基板は、動きの速い角化細胞が及ぼす力を測定する上で価値があることが証明されました。 しかし、これらの同じ基質は、ほとんどの哺乳動物細胞を研究するためにはるかに有用ではない。 トラクションを正確に計算するには、特定のセルタイプの運動性と力の発生に一致するように基板を調整する必要があります。 より高い力を発揮することができる低速移動セルのための所望のコンプライアンスのシリコン基板を正確に製造することは困難である。 この制限を克服するために、DemboとWang(1999)は、サブマイクロメータサイズの蛍光ビーズを埋め込まれたポリアクリルアミドの基質を使用しました。 ポリアクリルアミド基層の適合性は、単量体および架橋剤濃度を変化させることによって化学的に調整することができる（PelhamおよびWang、1997）。 ポリアクリルアミドはケイ素の基層上の複数の付加的な利点があります。 変形の広い範囲に、それは直線に伸縮性がある行動を表わす。 また、ポリアクリルアミドは、特定の細胞接着リガンドの抱合なしに、典型的にはそれ自体で細胞結合に適していない（Ｎｅｌｓｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2003). 従って、それは制御可能な、定義された方法で細胞付着そして行動を調査するための完全な足場である。

基板内の変形を使用してセルによって発揮されるトラクションを決定する計算方法は、前述の応力を受けたシリコン基板で使用される方法と非常によく似ています。 しかし、蛍光マーカーを使用すると、追跡方法と正確なひずみ場を計算する能力が大幅に改善されました。

DemboとWangは、得られた技術である牽引力顕微鏡を用いて、線維芽細胞の移動のメカニズムを解明するいくつかの研究を発表しました。 具体的には、彼らは、細胞の板状体が前方移動に必要な力のほとんどすべてを提供することを示している（Munevar et al.,2001a). それらの結果は、ラメリポジウムが細胞体の残りの部分とは異なる機械的実体であることを示している。 興味深いことに、細胞内のこの同じ機械的分裂は、おそらくそれらの運動挙動の違いを説明する、H-ras形質転換細胞には存在しないようである。 さらに、Ｂｅｎｉｎｇｏ ｅ ｔ ａ ｌ． (2001)は、トラクション発生の調節における焦点癒着の役割を調査し、焦点癒着の大きさが発生する力の量に反比例することを見出した。 さらに、癒着の分布は牽引力の分布とうまく対応していない。 著者らは、これらの結果は、初期の焦点複合体が強い推進力に関与していることを示している可能性があり、これらの接着部位の成熟は受動的な投錨部位への変化をもたらすと結論付けている。 さらに、Ｄｅｍｂｏらは、前対後癒着の動的な役割を調査した（Ｍｕｎｅｖａｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ １ｂ）、ミオシンＩｉｂ（Ｌｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ４）、焦点接着キナーゼ（Ｗａｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ １）、および伸張活性化Ｃａ２＋チャネルは、線維芽細胞の遊走において再生する（Ｍｕｎｅｖａｒ ｅ ｔ ａ ｌ．，２ ０ ０ １）。, 2004). 牽引力顕微鏡を使用して、Demboと同僚は、線維芽細胞の移動における力発生の役割を理解する上で重要な進歩を遂げている。

ポリアクリルアミドゲルを用いた最も重要な技術的進歩の一つは、ECM密度を変化させることなく細胞基質のコンプライアンスを確実に制御する 基板のコンプライアンスを調整することは、ほぼすべての細胞型の調査と機械的環境の関数としての細胞挙動の理解を可能にするため、牽引力顕微鏡の開発における重要な転換点であった。 Pelham and Wang(1997)による研究以前は、細胞遊走と接着を調査するほとんどの研究は、その可溶性化学環境（走化性）または基質に共役したリガンド（haptotaxis）に応答して細胞遊走に焦点を当てていた。 さらに、セルの機械的環境に関する研究では、流体せん断応力や機械的伸張などの課された力による応答に焦点を当てました。 しかし、基板の剛性を変更することにより、PelhamとWang（1997）は、研究者が細胞応答と機械伝達にアプローチする方法に大きな変化をもたらしました。 ポリアクリルアミド基層を用いて，ＰｅｌｈａｍとＷａｎｇは基板上のＥＣＭ密度を一定に保ち，機械的コンプライアンスを変化させた。 彼らは、線維芽細胞がそれらの基質の機械的コンプライアンスに積極的に応答することができることを実証した。 より硬いゲル上の細胞は、より準拠したゲル上の細胞よりもより広がり、よりゆっくりと移動する。 さらに、細胞が基質の機械的適合性を感知する能力は、焦点接着構造内に含まれる多数のタンパク質のリン酸化状態を変化させる能力に反映される。 堅い基質の焦点付着はより迎合的な基質の焦点付着がより少なくリン酸化されたpp125fakおよびpaxillinを含み、はるかに不規則に現われる一方、より大きく、よ これらの結果は、機械的なECMキューは、細胞接着を調節する上で化学的なキューと同じくらい重要である可能性があることを示唆した最初のものでした。

Pelham and Wang(1997)の独創的な記事以来、多くの研究が細胞の行動に対するコンプライアンスの影響を調査してきました。 Lo et al. (2000)はポリアクリルアミド化学を用いて、剛性のステップを含む基板を作成しました。 彼らは、細胞が積極的に基質のコンプライアンスの変化を検出し、応答することができたデュロタキシスと呼ばれる行動を示した。 硬い基板上の細胞は，硬い基板上に交差するが，硬い基板上の細胞は，より高いトラクションとより多くの広がり面積を示し，硬い–柔らかい境界に応答して後退または方向を変化させた。 後に、Wong et al. (2003)は、Loおよび同僚によって行われたように、ステップではなく、コンプライアンスの勾配を含むポリアクリルアミドヒドロゲル上で移動する線維芽細胞の能 彼らは、血管平滑筋細胞が硬い基質（15kPa対25kPa）よりも柔らかい基質上で速く移動する傾向があり、細胞が硬い基質上に蓄積する傾向があることを発見 さらに，勾配に準拠したゲル上の遊走パターンは，細胞遊走の典型的なランダムウォークパターン特性を示すのではなく，より硬いゲル領域に向けられているように見えた。 Engler et al. (2004)は、準拠したゲルに対する細胞応答をさらに調査し、応答が大部分がアクチン細胞骨格の組み立てによって媒介されることを示した。 細胞骨格の変化を試験することにより、Englerらは、細胞内のアクチンのわずかな過剰発現が、柔らかいゲル応答に見られる広がりの損失を補うことがで さらに、Yeung et al. (2005)は、コンプライアンスセンシングの感度しきい値が細胞型特異的であり、細胞–細胞接触も、より硬い基質上の細胞の形態により密接に類似するように、, 2005). 全体として、durotaxisの研究はまだ比較的若く、多くの細胞が機械的に感知し、その基板と環境の材料特性に応答する方法について学ぶことが残っています。