100日の進化後のエタノール耐性を改善
野生型一倍体K.marxianus株は、6%(v/v)エタノールを含む培地で30℃で100日間培養した。約450世代（詳細はメソッドを参照）。 この期間中、バイオマスの継続的な増加（毎日ＯＤ６ ０ ０によって測定）があった（図１ ０Ａ）。 図1a)に示すように、エタノールストレス下での細胞生存が改善され得ることを示す。 最後に、エタノールに対する耐性が大幅に改善されたK.marxianus個体群を得た（図10）。 1b）。 全体を通して、KMは進化前の生の株を指し、KM-100dは100日の進化後のK.marxianus個体群を指します。 ＫＭの最大エタノール回復力は７％（ｖ／ｖ）であり、ＫＭ−１ ０ ０ｄの場合、１ ０％までであった（図１ ０）。 1b）。 我々は、異なるエタノールレベルと培地中のKMとKM-100dの間の成長プロファイルを比較した(0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v/v,Fig. 1c）。 エタノールの非存在下では，株間に有意差はなかった。 それらの差は、エタノールレベルの増加とともに増加し、培地中の6％（v/v）エタノールで最大に達した。 このような状況では、48時間後、KM-100dのバイオマスはKMのバイオマスよりもほぼ二倍高かった。 株の両方が7％のエタノールと培地中で遅れた成長を示し、8％のエタノールと培地中で成長することができませんでした。 さらに、KM-100dはまた、6％のエタノールでKMよりも顕著に高い最大成長率を示した（追加ファイル1：図S1）。
k.marxianusは6%(v/v)エタノールで進化した。 進化中のk.marxianus個体群の毎日のOD600値。 細胞を毎日移し、6％（v/v）エタノールを含有する新鮮な培地に継代培養し、同じ初期OD600が0.6であった。 次いで、軌道シェーカー中で30℃で24時間インキュベーションした後、OD600を測定して細胞増殖を記録した。 bは前と後進化間のエタノールの許容のための希薄の分析を斑点を付けました。 KMおよびKM-100d細胞は、勾配濃度のいずれかでエタノールを液体培地に接種した: 0, 1, 2,…, 11% (v/v)をそれぞれ、30°Cで3日間インキュベートした。 液体培地からの１ ０ＯＤ６ ０ ０の細胞懸濁液を５倍連続希釈し、ＹＰＤプレート上にスポッティングし、３ ０℃で２日間培養した。 異なるエタノール濃度でのKMおよびKM-100dのc成長プロファイル。 赤い曲線はKM-100dの場合、黒い曲線はKMの場合です。 成長プロファイル測定中に、KMとKM-100dは、両方の生物学的三重で行われました
DNA解析は、K.marxianusが適応進化中に倍数性または重要な遺伝子の変化を持たないことを示唆している
KM-100dのDNA変化を解明するために、DNA倍数性解析とDNA変異同定を行った。 適応進化の間、K.marxianus個体群のDNA含有量はほとんど変化しない（追加ファイル1：図S2）ので、倍数性の変化は起こらなかった。 K.marxianus DMKU3-1042の参照ゲノムにマッピングされたKMおよびKM-100dのDNA-seq解析により、KMとKM-100dの間のSNPサイトが得られた（追加ファイル2）。 同定された57Snpのうち、唯一の4サイトは、KM-100d人口で支配的であった。 そのうちの三つはSAN1、YAP1、およびKHT2遺伝子のコード領域に位置しており、もう一つはERG26の445bp上流に位置している。 SAN1の1324サイトは、CからTに変異し、その結果、対応するアミノ酸は、アルギニンからシステインに変換されました。 しかし、Pfam32の分析によると。0、この変異は、任意の同定されたタンパク質ドメインに分類されません。 YAP1およびKHT2の突然変異は両方とも蛋白質の変更なしで同義の突然変異です。 上記の知見は、DNAコンテキストの変化は、KM-100dのような表現型の改善をサポートするのに十分ではないことを示唆しており、転写リプログラミングは、こ そこで、さらにＲＮＡ-ｓｅｑ解析を行った。
100日進化によって誘導されるグローバル再配線
エタノール耐性を徹底的に理解するために、我々は4％と6％（v/v）エタノールで培地で成長したKMとKM-100d酵母の遺伝子発現を比較するためにRNA-seq解析を行った。 成長プロファイルに基づいて（図。 1c)、KM-100dとKMの間の成長能力が48hで最大差を有することが観察された;従って、48hでのサンプルをRNA-seq分析のために収集した。 |Log2ratio|≤1およびp値<0を設定します。有意差発現（Ｄ Ｅ）遺伝子を定義するための基準として、７つのグループでＤ Ｅ遺伝子同定を行った（図３）。 として表される2 1, 2, 3, 4, 5, 6, および7）。 各群において、対照を指す矢印に従ってＤ ｅ分析を行った。 追加のファイル3は、すべての遺伝子の発現値および差動発現統計量を提供する。 KMとKM-100dの間には、両方ともエタノールを含まない培地で成長したときのグローバルな発現差があります（図。 2グループ）。 KM-100d酵母はKM酵母よりも高い発現を有する1342個の遺伝子を有するが、188個の遺伝子のみが低い発現を有する。 4％および6％（v/v）エタノールを有する培地では、KM-100dにおけるアップレギュレート遺伝子の数は、それぞれ415（群γ）および453（群γ）に大幅に減少する。 しかし、アップレギュレートされた遺伝子数は、依然として低い発現（それぞれ104遺伝子および182遺伝子）を有する遺伝子よりもはるかに多い。 これらの結果は、KM-100d酵母が多数の遺伝子を活性化することによって転写的に再配線されることを示唆している。 この提案は、KMおよびKM-100d酵母内のエタノール誘発発現変化によってさらに支持された。 4％および6％（v/v）エタノールの誘導下では、KM酵母は1452および1465のアップレギュレート遺伝子（群γおよびγ）を有するが、KM-100d酵母はそれぞれ631および596のアップレギュレート遺伝子（群γおよびγ）のみを有する。 また、ヒートマップを適用しました。2log2ratio値に基づいて遺伝子およびグループをクラスター化するRパッケージ内のソフトウェア（追加ファイル1：図S3）と、グループσの遺伝子差動発現プロフ 一緒に取られて、KM-100d酵母は、彼らがエタノールフリー培地で成長した場合でも、多くのエタノール誘発発現機能を維持しました。 この特徴は、進化した細胞を新進のエタノール刺激により適応させる、すなわちKM-100d酵母はKMほど多くの遺伝子を活性化する必要はない。
エタノールストレス下でのKMおよびKM-100dにおけるRNA-seqデータのグローバル解析。 この図では、遺伝子差発現解析のためのRNA-seqデータを区画化しました。 KMおよびKM-100dは、それぞれ、左右の部分に提示され、エタノール濃度0％、4％、および6％（v/v）は、行に位置していた。 RNA-seqデータに分けられた、と記す．ただし①、②、③、④、⑤、⑥、⑦. 各グループでは、矢印は差動発現同定のためのコントロールを指し、赤の数字はアップレギュレートされた遺伝子数を示し、緑の数字はダウンレギュレートされた数を示します
続いて、各グループにおいて、DE遺伝子の遺伝子オントロジー（GO）濃縮解析を行った（追加ファイル1: 図S4）、および濃縮されたGO用語は、リボソームの生合成、アミノ酸生合成、DNA修復、RNA処理などを含む細胞の基本的な生理学的プロセスの広い範囲をカバー、しかしエタノールの抵抗に直接関連していない。 そこで、以下では、特にエタノール代謝および耐性に強く関連する経路に焦点を当て、関連するDE遺伝子を解析することにより（追加ファイル4）。
KM-100d強化されたエタノール使用
グラフの説明を容易にするために、関連するDE遺伝子のlog2ratio値（追加ファイル4）を五つの間隔に細分しました: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (に示すようにする。 3.
k.marxianusにおけるエタノール消費経路の可能性。 この図では、エタノールは細胞質（上部）およびミトコンドリア（下部）の両方で消費される。 青–灰色矩形は、関係する遺伝子群の①、②、③、④、⑤、⑥と⑦は定義する。 2. グループ番号の赤と緑は、それぞれ遺伝子のアップレギュレーションとダウンレギュレーションを示します。 色の強度は遺伝子発現の変化の程度を表し、色とlog2ratio値の対応は図の左上隅のカラーバーによって定量化されます
エタノール消費量におけるKMとKM-100dの差を調べた。 図に示すように。 図3に示すように、エタノールを直接消費するための二つのルートが存在する可能性があり、エタノールに直面したときにKMとKM-100dでアップレギュレートされた（群γ、γ、γ、およびγ）。 一つの方法は、nadp+によって促進されるアセトアルデヒドにエタノールを触媒する細胞質ADH6を介してである。 他はアセチルCoAの援助が付いているエタノールのエステル化を促進するmitochondrial ATF1によってあります。 特に、エタノールストレス（群γおよびγ）下のKM-100dでは、YGL039Wはより多くのNADP+を生成するためにアップレギュレートされ、エタノール毒性を低減するためにエタノールアセトアルデヒドに変換するためのより多くの補酵素を供給する可能性がある。 ミトコンドリアでは、エタノールストレス（グループγとγ）で露出したKMのために、唯一のC2E1P301とADH4がアップレギュレートされました。 KM-100dでは、エタノールからアルデヒド、酢酸へのプロセス中に、C2E1P301、ALD4、ADH3、ADH4、およびALD6はすべてアップレギュレートされた（グループγ）。 前述の変更はKM-100dがエタノールの消費を高めることによってエタノールの毒性を軽減する新しい機能を得るかもしれないことを示します。 理論はKM-100dがエタノールとの媒体のKMに行ったことを説明します。
KM-100dは、膜脂質生合成、抗浸透圧、抗酸化ストレス、タンパク質フォールディングを強化し、エタノールストレスに抵抗する
蓄積されたエタノールは、細胞膜の完全性に直接影響を与え、内浸透圧と外浸透圧を変化させ、タンパク質立体配座を乱し、活性酸素種（ROS）生成を誘導し、酵母細胞に深刻な損傷を引き起こす。 以下では、これらの経路におけるDE遺伝子を、K.marxianusにおける抗エタノールによる損傷について解析した（図。 4).
抗エタノールの模式図はＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓに損傷を与えた。 この図の左の部分では、培地中に蓄積されたエタノールは、酵母細胞に浸透圧を課し、続いて浸透圧応答経路を活性化する。 中間部では、環境エタノールが細胞に浸透し、細胞膜を破壊する。 右の部分では、損傷した細胞膜を強化し修復するために細胞膜脂質が合成される。 下部では、エタノールはタンパク質の立体配座を乱し、酸化ストレスを引き起こし、関連するセンサーと応答経路が活性化される。 遺伝子の差動発現のための群番号および色は、図１の群番号および色と一致している。 3
エタノール駆動進化後、KM-100dのアルコールストレス応答経路が活性化された。 エタノール曝露時に細胞質から核に移動するASR1と、熱ショックタンパク質遺伝子のエタノール依存性転写活性化に役割を持つ細胞質保持タンパク質として作用するETP1は、KM-100d（グループγ）ではアップレギュレートされ、KMに直面したエタノール（グループγとγ）では部分的にアップレギュレートされ、エタノールフリー培地でもKM-100dはKMのエタノールに対する応答と同様に、エタノール挑戦の応答経路を準備する可能性があることを示唆している。
膜脂質の形成は、エタノールストレス下で細胞膜の完全性を維持する上で重要な役割を果たす。 細胞膜構造の重要な構成要素である不飽和脂肪酸は、エタノール耐性と密接に関連している。 図に示す。 図4に示すように、アセチルCoAから不飽和脂肪酸生合成からリン脂質への取り込みまで、関与する遺伝子PPT2、FAD2、およびTAZ1はすべてKM-100d（グループγ）でアップレギュレートされており、進化後、KM-100dはすでに不飽和脂肪酸生合成を強化して細胞膜生物形成のためのより多くの原料を供給する可能性があることを示唆している。 また、エタノール中に暴露されたKMにおける遺伝子ACC1、TSC13、FAS1（群γおよびγ）のダウンレギュレーションは、適応進化の前にK.marxianusの弱いエタノール耐性を説明する
ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、ステロールなど、細胞膜脂質の生物発生に関連する多数の遺伝子が、エタノールストレス下で差動的に発現した（図。 4). 特に、ホスホグリセリド生合成に関与する遺伝子は、一般的にKM-100d（グループγ）とKM直面エタノール（グループγとγ）でアップレギュレートされ、ホスホグリセリドがエタノール耐性のための細胞膜の主要な成分である可能性があることを示している。 ステロール生合成では、多くの遺伝子（例えば、ERG9とERG7）は、グループγとγでダウンレギュレートされ、いくつかの遺伝子は、グループγ（例えば、ERG25）とグループγ（例えば、ERG26）でアップレギュレートされた、ステロールの生合成は、高エタノールに立ち上がるために重要であるが、低エタノールには重要ではないことを示唆している。 また、ホスホグリセリドとステロール生合成に関与する遺伝子CKI1、ERG2、およびERG25は、グループγでのみアップレギュレートされた;これは、高エタノール中のKMよりもKM-100dの優れた性能のための手がかりの一つである可能性があります。
培地中のエタノール濃度が高いと、酵母細胞に浸透圧ストレスがかかります。 図に示すように。 図4に示すように、原形質膜浸透圧センサー（SLN1、OPY2、およびSHO1）、および下流応答経路に関与する遺伝子（HOG1、SSK1、およびSSK2）は、すべての低エタノール（グループγ）に露出したKMでアップレギュレートされ、個別にKM-100d（グループγ）、KM-100dに直面したエタノール（グループγおよびγ）、およびKMに直面した高エタノール（グループγ）でアップレギュレートされた。 グリセロールの生産は浸透圧に抵抗するS.cerevisiaeのための主要な方法です。 KMとKM-100dがエタノールに直面したとき、グリセロールの生合成に関連するほとんどの遺伝子はダウンレギュレートされた。 以上の知見は、進化の前後に、K. しかし、浸透圧ストレスに抵抗するための戦略は、グリセロール生産ルートに依存しない可能性があり、いくつかの他の方法が存在しなければなりません。
細胞壁は浸透圧に耐えるのに十分な機械的強度を提供し、分泌経路は細胞壁タンパク質を外側に輸送するだけでなく、膜構造を強化するために脂質を原形質膜に輸送するため、これら二つのプロセスが抗浸透圧ストレスの原因となる可能性がある。 我々は、分泌経路および細胞壁の生物形成におけるDE遺伝子を分析した（追加ファイル1：図S5）。 分泌経路と細胞壁の生物形成に関与する遺伝子は、一般的にKM-100d（グループγ）でアップレギュレートされ、それらのいくつかはまた、エタノール（グループγとγ）で露出したKMでアップレギュレートされた。 これは、KM-100dは、エタノールストレスに耐性KMの分泌経路のアップレギュレーションを維持しただけでなく、広くエタノール攻撃の準備のために分泌経路の活性化範囲を拡大していることを意味します; したがって、分泌経路と細胞壁形成の強化は、エタノールによる浸透圧ストレスに耐えるために開発された新しい戦略KM-100dである可能性があります。 一方、低エタノール（群γおよびγ）に曝されたKMおよびKM-100dについては、分泌経路の多くの遺伝子が両方ともダウンレギュレートされ、分泌経路の活性化がK.marxianusが低エタノールに応答するために必要な方法ではない可能性があることを示唆している。
エタノールによって誘発される酸化ストレスに対するため（図。 4)、ヒドロペルオキシド応力のセンサとトランスデューサとして機能するHYR1は、KMとKM-100dの両方の高エタノール（グループσとσ）にさらされてアップレギュレー 酸化ストレス応答性転写因子SKN7とSTB5は、KM-100d（グループγ）とKMで高エタノール（グループγ）に直面していたアップレギュレートされました。 抗酸化ストレスのために、スーパーオキシドジスムターゼシステム（例えば、MTM1とPRX1）に関与する遺伝子は、一般的にキロ-100dでアップレギュレートされたエタノール チオレドキシン系の場合、遺伝子（例えば、MXR1およびTRR1）は、KMおよびKM-100dの両方に直面したエタノールでアップレギュレートされた。 チオレドキシンとそのレダクターゼはまた、複数のリグノセルロース由来の阻害剤に対するK.marxianus耐性を高めることが報告されています。 グルタレドキシンシステムのために、遺伝子GRX2とGLR1は、高エタノール（グループγ）にさらされたKM-100dでのみアップレギュレートされました。 ペルオキシソーム生物形成のために、PEX6およびPEX7などの遺伝子は、KM-100d（群γ）でアップレギュレートされ、いくつかの他の遺伝子（例えば、PEX3およびINP2）は、低エタ 上記はKM-100dが全体的に反酸化能力を増強するかもしれないことを意味します。
エタノールストレス下で適切なタンパク質折りたたみを確保するために（図。 図4)に示すように、熱ショック転写因子HSF1はKMおよびKM-100d直面した低エタノール（群γおよびγ）でアップレギュレートされ、多くのシャペロン関連遺伝子（例えばPFD1およびCPR7）はKM直面したエタノール（群γおよびγ）でアップレギュレートされ、またKM-100d（群γ）でアップレギュレートされた。 いくつかの遺伝子（例えばCPR4）は、KMに直面したエタノールでダウンレギュレートKM-100dでダウンレギュレートされていませんでした。 従って、KM-100dは一般により安定した細胞環境を提供するために蛋白質の折ることを高めるかもしれません。
S.cerevisiaeでは、トレハロースが酵母細胞への過剰塩の流入を防ぐために適合溶質として働くため、トレハロースの蓄積がエタノール耐性にとって重要であることが報告されていたが、トレハロースの分解に関与する遺伝子もエタノールによって誘導され、最適濃度に調整された。 K.marxianusのために（Fig. 4）、我々は、トレハロースの生合成と分解に関与する遺伝子（例えば、トレハロースの生合成と分解に関与する遺伝子）を発見した。、NTH1およびTSL1）は、低エタノール（群γおよびγ）で処理したときに一般的にアップレギュレートされたが、高エタノール（群γおよびγ）で暴露されたときにトレハロース代謝 これは，ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓでは，トレハロース蓄積は低エタノールに対処するための特別な戦略であるが，高エタノールには対処しないことを示唆している。
上記のエタノール耐性経路に関与する15個の遺伝子の差動発現をRT-qPCR解析で検証した（図。 5). グループγにおける遺伝子の発現（Fig. 5a）は一般的にアップ規制された。 一方、γ群における遺伝子のアップレギュレーション（図。 および群γ（図５ｄ）および群γ（図５Ｄ）を含む。 群γ（図５Ｅ）ほど高くはなかった（図５Ｅ）。 および群γ（図５Ｂ）および群γ（図５Ｂ）を含む。 5c）。 我々の分析は、エタノール耐性に寄与する遺伝子が継続的にもエタノールストレスの撤回後KM-100dで活性化されていることを確認しました。 連続的な遺伝子発現は、細胞内環境を安定させ、今後のストレスにおける細胞の成長に利益をもたらすのに有用である可能性がある。
異なるグループにおけるKMおよびKM-100dの遺伝子差動発現のためのRT-qPCR解析。 エタノールフリー培地中のKM-100d対KMの両方。 これはグループγのDE遺伝子解析のためのものです。 b KMは、エタノールフリー培地中のKM対4％（v/v）エタノール中に暴露された。 これはグループ⑥のためのものです。 c KMは、エタノールフリー培地中のKM対6％（v/v）エタノールで暴露された。 これはグループ⑦のためのものです。 d KM-100dは、エタノールフリー培地中で4％（v/v）エタノール対KM-100dで暴露された。 これはグループ④のためのものです。 e KM-100d6%(v/v)エタノール対KM-100dエタノールフリー培地で露出しました。 これはグループ⑤のためのものです。 各サンプルでは、18Sは内部制御として使用されました。 総RNAは、生物学的三重に48時間で培養した細胞から単離されました
KM-100d
におけるエタノール消費量の増加と多重ストレス耐性の検証我々は、異なる炭素源を有するYNB培地中のKMおよびKM-100d酵母の成長を確認した(図1)。 6a）。 KMとKM-100d酵母の両方が唯一の炭素源としてグルコースを利用するのと同じ能力を持っています。 しかし、唯一の炭素源として1％および2％（v/v）エタノールの存在下では、KM-100d酵母はKM酵母よりも良好に成長した。 結果は、KM-100d酵母がKM酵母よりも効率的にエタノールを利用したという前述の仮説を支持している。
複数のストレス下でのエタノールおよび細胞生存率および発酵に関する細胞増殖アッセイ。 炭素源としてのグルコースまたはエタノールに基づくKMおよびKM-100dの細胞増殖アッセイ。 10OD600の細胞懸濁液を五倍連続希釈し、唯一の炭素源としてグルコースまたはエタノールとYNBプレート上にスポットし、カラムに沿って示されているように、2日間培養した。 熱応力下でのKMおよびKM-100dのb細胞生存率アッセイ。 温度は、酸化ストレス下での３ ０℃、３ ７℃、４ ０℃、および４ ５℃である。 H2O2は酸化刺激として使用され、集中は0%、0.04%、0.06%、および0.08%です。 浸透圧の下のdの細胞の生存率。 高塩（NaCl）は、0M、0.5M、0.6M、および0の濃度で、浸透圧を引き起こすために使用されました。基本的な状況のKMおよびKM-100dの7m.eのエタノールの収穫そしてブドウ糖の利用。 f45℃でのエタノール収率およびグルコース利用gエタノール収率および6％（v/v）エタノールストレス下でのグルコース利用。 8%(v/v)エタノールの圧力の下のhのエタノールの収穫そしてブドウ糖の利用。 サブ図b-dでは、KMとKM-100dはそれぞれ第1行と第2行にあります。 10OD600の細胞懸濁液を5倍連続希釈し、YPDプレート上にスポットし、2日間培養した。 指定された温度の熱試験を除いて、他の試験はすべて30℃で実施した。 サブ図e-hにおいて、左のy軸および右のy軸は、それぞれ培地中のグルコース残基（黒で示される）およびエタノール生産（青で示される）を表す。
に基づいて、図１ １に示す。 4、KM-100dは浸透圧力、酸化圧力および熱圧力を含むエタノールによって引き起こされる多数の圧力への抵抗を、同時に開発するかもしれません（蛋白質 複数のストレスに対する酵母の許容性を評価するために、我々は、それぞれ、様々な温度、酸化、および浸透圧のための細胞生存率アッセイを行った（図10）。 6b-d）。 基本的な状況（すなわち、30℃、0％H2O2、および0M NaCl）では、KMとKM-100d酵母の間に生存率の差が欠けている。 しかし、異なるストレスの存在下では、KM-100d酵母はKM酵母のそれよりも有意に良好な生存率を示す。 さらに、利点はより重要であるが、ストレスはより深刻になった（図。 6b-d）。 複数の応力に対する許容誤差がエタノール生産における酵母に新しい特徴をもたらす可能性があることを期待した。
我々はさらに、複数のストレス下でKMとKM-100d酵母の間のエタノール生産性を調べた。 基本的な状況（30°Cおよび0%のエタノール、Fig. 6e）、KMおよびKM-100d酵母は、グルコース消費およびエタノール生産の両方においてほぼ同じである。 しかし、KM-100d酵母は、高温の存在下で有意な利点を示した（45℃、図。 または８％、図６Ｆ）以上のエタノール（６％または８％、図６Ｆ）以上のエタノール（６％または８％、 6g、h）; 一般的な環境は、通常、発酵の後期段階で起こった。 本発明者らは、ＫＭおよびＫＭ−１ ０ ０ｄ酵母の両方について、４ ８時間、７ ２時間、および１ ２ ０時間で６％エタノールで培地中で発酵させたＲＴ−ＱＰＣＲ分析を行った（図１ ４Ａ）。 7). これらのエタノール耐性遺伝子の大部分は、特にエタノールへの初期調整のための初期段階（４ ８時間）において、ＫＭ−１ ０ ０ｄにおいてＫＭと比較して上方調節された（ 7). 要約すると、エタノール耐性遺伝子の発現をアップ調節することにより、KM-100d酵母は、エタノール収率の増加とストレスの多い環境下でKM酵母を上回った。
発酵中のKMおよびKM-100dにおける遺伝子発現のRT-qPCR解析。 KM-100d対KMの両方で発酵中の48時間である。 b KM-100d対KMの両方で発酵中72時間。 c KM-100d対KMの両方で発酵中120時間。 各サンプルでは、18Sは内部制御として使用されました。 KMおよびKM-100dの両方を6％エタノールで培地中で培養した。 生物学的に三重に培養された細胞から全ＲＮＡを単離した。
