結果
KLF2の発現は、マクロファージへの単球の活性化/分化と減少します。
単球/マクロファージなどの免疫細胞の調節におけるKLF2の役割をよりよく理解するために、我々は最初に一次ヒト単球におけるKLF2の発現を評価した。 図に示すように。 1左、KLF2発現は、一次ヒト単球で堅牢であり、強く5日後にマクロファージへの分化に伴って減少します。 ヒト単球細胞株THP-1におけるKLF2発現は、一次ヒト単球におけるそれよりもはるかに低かった。 しかし、これらの細胞をＬＰＳまたは１ ２−ｏ−テトラデカノイルホルボール−１ ３−酢酸で処理すると、細胞の活性化または分化を誘導するために十分に確立された２つの薬剤の発現がさらに減少した（図１）。 1A右）。
我々は、次にKLF2発現がin vivoで炎症性の設定で調節されているかどうかを決定しようとした。 単球活性化は、アテローム性動脈硬化症、慢性低悪性度の炎症状態の開発における重要な病態生理学的イベントであるので、我々はKLF2発現は、これらの患者（11） 我々は、炎症（12）のマーカーとして機能することが示されているFinkel-Biskis–Jinkins骨肉腫遺伝子（FOS）の最低および最高レベルによって層別化されている14の年齢にマッチした正常な被験者と広範なアテローム性動脈硬化症（冠動脈血管再建の歴史と≥50％）を持つ14人の患者のグループを検討した。 図に示すように。 図1Bに示すように、KLF2発現は患者において30％以上有意に減少した。 対照的に、KLF3、KLF6、KLF11、およびKLF13について有意な効果は観察されなかった。 我々の以前の研究と一致して、fosの発現が有意に冠動脈疾患（患者で増加した12）。
KLF2は単球活性化および貪食能力を阻害する。
炎症性刺激に応答して、単球は炎症誘発因子およびサイトカイン/ケモカインのレベルの増加を発現し、貪食能力の強化を示す。 単球機能におけるKLF2の役割への洞察を得るために、我々は過剰発現研究を行った。 ＴＨＰ−１細胞を、対照空ウイルス（Ｅ Ｖ）またはＫＬＦ２（Ａ ｄ−ＫＬＦ２）のいずれかに２ ４〜４ ８時間感染させ、次いで、ＬＰＳで２および６時間刺激した。 ＥＶ感染細胞をＬＰＳ（２ ５ｎｇ／ｍｌ）で処理すると、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２、組織因子、および単球化学誘引タンパク質（ＭＣＰ）−１ｍＲＮＡの堅牢な誘導がもたらされた。 対照的に、この誘導は、ＫＬＦ２感染細胞で顕著に弱毒化された（図１ ０Ｂ）。 2A）。 同様の効果がマウス単球細胞株Ｊ７ ７ ４Ａにおいても観察された（データは示さない）。 さらに、KLF2の過剰発現は強く、様々なサイトカインとケモカインの分泌を阻害した。 図に示すように。 2B、KLF2過剰発現は、CD40L（49.6％）、マクロファージ炎症性タンパク質1α（48.4％）、マクロファージ炎症性タンパク質1β（64.2％）、IL-1β（55.0％）、IL-8（79.1％）、TNF-α（50.2％）、およびMCP-1（68.8％） この効果は、複数の他の関連増殖因子（Ｔｇｆ Β１、血小板由来増殖因子、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子）、サイトカイン／ケモカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１ ０、ＩＬ−１ ２ｐ４ ０、ＩＬ−１ ２ｐ７ ０、ＩＬ−１α、
KLF2過剰発現は単球活性化を阻害する。 (A)KLF2過剰発現は、炎症性遺伝子発現を阻害する。 ノーザンブロット分析は、示されたように様々な時点のＬＰＳによる刺激後の対照として、ＡＤ−ＫＬＦ２（ＫＬＦ２）またはＥＶで過剰発現されたＴＨＰ−１からのレーン当たり１ ０μ ｇの全ＲＮＡ (B)KLF2過剰発現は、サイトカイン/ケモカイン精緻化を阻害します。 刺激後、培養上清を回収し、サーチライトプロテオームアレイ/マルチプレックスサンドイッチELISAによって評価した。 各サンプルは、重複して評価し、二つの独立した実験は、生物学的マーカーのパネルについて評価しました。 同様の結果が異なる実験で観察された。 (C)KLF2は食作用を阻害します。 ＥＶ感染およびＫＬＦ２感染ＴＨＰ−１細胞を、ＬＰＳ（２ ５ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、食作用アッセイを、材料および方法に記載されるように行った。 （ＤおよびＥ）ＫＬＦ２は単球動員を阻害しない。 Dでは、i.p.チオグリコール酸注射後に腹腔に動員されたGFP陽性細胞の代表的なフローサイトメトリー分析が示されている。 ゲートバーは、分析中のＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。 Ｅでは、群当たりｎ＝５マウスからの要約結果が提供される。 （Ｆ）ＫＬＦ２過剰発現Ｊ７ ７ ４Ａ細胞を用いた材料および方法に記載されている免疫不全マウスの再構成は、カラギーナン誘発性炎症の１−ｈおよび２−ｈ期間の両方 データは±ＳＥＭ（ｎ＝４）で表される。 （Ｇ）ＫＬＦ２は、組織浮腫を減少させる。 カラギーナン注入足（×100倍率）の断面は、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。 KLF2過剰発現単球で再構成されたマウスからの足は、矢印でマークされた減少した血管外漏出流体を示しています。 筋肉（M）や骨（B）などのランドマークが示されています。 （HおよびI）KLF2のノックダウンは、炎症性遺伝子発現を増加させる。 Ｊ７ ７ ４ａ細胞を、ノーザンブロット分析（Ｈ）および定量的リアルタイムＰＣＲ分析（ｉ）によって評価した４ ８−ｈ標的遺伝子について、非特異的（ＮＳ）またはｓｉＲＮＡをＫＬＦ２（ＳＩＫＬＦ２）に Iのグラフは、3つの実験からのデータを組み合わせたものです。
活性化された単球/マクロファージの古典的な特徴は食作用である。 KLF2過剰発現が単球の貪食能力に影響を与えるかどうかを決定するために、我々はKLF2またはTHP-1細胞におけるコントロール（EV）を過剰発現し、LPSで刺激し、テキ 図に示すように。 図2Cに示すように、zymosan bioparticlesを摂取したコントロールウイルス感染細胞。 対照的に、ＫＬＦ２発現単球による取り込みは顕著に減少した（図１ ０Ａ）。 2C）。 まとめると、これらのデータは、ＫＬＦ２がサイトカイン／ケモカインの単球分泌および食作用を阻害することができることを実証する。
KLF2は単球の動員を阻害しない。
我々は次に、IN vivoでの単球機能に対するKLF2の効果を評価しようとした。 傷害または炎症性刺激に応答して、単球は血流から組織に動員される。 我々は、最初の単球の募集はKLF2発現によって変更されたかどうかを評価するための研究を行った。 他の細胞型の寄与を最小限に抑えるために、我々は、T、B、およびナチュラルキラー細胞が欠損しているC.B-17-Scid-ベージュマウスを使用しました。 次いで、これらの動物（群当たりｎ＝５）を全身照射に供し、尾静脈注射（材料および方法に記載）により、対照ウイルス（Ｅ Ｖ）またはＫＬＦ２のいずれかにアデノウイルス感染したＪ７ ７ ４Ａ細胞で再構成した。 次いで、動物にチオグリコール酸（単球動員を誘導する強力な化学的刺激剤）のi.p.注射を行い、GFP陽性細胞の数をフローサイトメトリー分析によって48時間後 図に示すように。 図2CおよびDに示すように、KLF2はgfp+J774A単球の腹膜腔への動員を阻害しなかった。 実際、本発明者らは、ＫＬＦ２形質導入動物がＧＦＰ＋細胞の有意な増加を示したことを再現可能に観察した。 これらのデータは、KLF2が阻害するのではなく、炎症部位への単球の募集を増加させることを示唆している。
KLF2はカラギーナン誘発性炎症を阻害する。
動員と組織への移動の後、単球はサイトカイン、ケモカイン、成長因子を分泌して炎症反応を永続させます。 図に示すように。 図2Bに示すように、我々は、KLF2過剰発現は、いくつかのサイトカインおよびケモカインの精緻化を減衰させることに留意した。 カラギーナン誘発フットパッド注射：KLF2は単球炎症前機能に影響を与えるかどうかを決定するために、我々は炎症のために十分に確立されたモデルを使 この化学物質の注射は、足の浮腫（13-15）を特徴とする炎症反応を再現可能に誘導することが以前に示されている。 Ｂ−１ ７−Ｓｃｉｄ−ｂｅｉｇｅマウス（１群当たりｎ＝４）を上記のように照射し、対照またはＫＬＦ２発現Ｊ７ ７ ４Ａ細胞で再構成し、次いで、足蹠（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓに記載されている）におけるカラギーナン 足の容積は、小容積用に修正された水浸度計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、Ｍｉｌａｎ）を使用して決定した。 図に示すように。 図2F、EV感染動物は、それぞれカラギーナン注射の1と2時間後の足の体積の17±1.08mm3と23.3±3.05mm3の増加を示した。 対照的に、KLF2を発現するJ774A細胞で再構成した動物は、カラギーナン注射後1時間および2時間でそれぞれ6.25±0.85mm3および7.5±0.95mm3の足容積の増加のみを示した(図1)。 2F）。 この総効果と一致して、足の組織学的分析は、浮腫形成をもたらす減少した流体の血管外漏出を明らかにした（図１ ０Ａ）。 2G、矢印）。
炎症性遺伝子発現に対するKLF2ノックダウンの効果。
単球性炎症性遺伝子発現におけるKLF2の重要性を決定するために、低分子干渉RNA（siRNA）を介したノックダウン研究も行われた。 図に示すように。 図２に示すように、未処理（対照）および非特異的siRNA処理細胞と比較して、J774A細胞におけるKLF2のノックダウン（≧60％ノックダウン）は、MCP-1のような炎症性遺伝子の誘導およびCOX-2および組織因子発現レベルに対するより控えめな効果をもたらした。 これらの結果はまた、リアルタイムＰＣＲ分析でも検証された（図１）。 2I）。
KLF2はNF-κ bおよびAP-1プロモーター活性を阻害する。
KLF2は、MCP-1、COX-2、および組織因子のLPS媒介誘導を強力に阻害することができる（図1）。 2A）。 炎症誘発性刺激によるこれらの標的の誘導は、ＮＦ−κ ＢおよびＡＰ−１のような転写経路によって調節されることが知られている。 我々は、原理的には、KLF2は、発現、DNA結合、または転写活性の誘導などの複数のレベルでこれらの経路を阻害する可能性がある、と推論した。
まず、炎症における中心的な役割を考えると、NF-κ bに焦点を当てました。 ＫＬＦ２の過剰発現は、ｐ６ ５の核蓄積またはＩｋｂキナーゼ（ＩＫＫ）αおよびＩｋｋｙの核レベルを変化させなかった（図３）。 3A）。 さらに、ＫＬＦ２過剰発現は、Ｉｋｂのリン酸化または分解の速度論、またはＩｋｋａ、Ｉｋｋ Β、およびＩｋｋｙの細胞質レベルを変化させなかった（図３）。 3B）。 これらの観察と一致して、ＫＬＦ２は、ＤＮＡへのＮＦ−κ Ｂ結合に影響を及ぼさなかった。 図に示すように。 図3Cに示すように、LPSによる対照ウイルス感染細胞（EV）の処理は、単一の主要なバンドを誘導した。 競争と超シフトの研究は、このバンドがNF-γ βを表すことを確認しました。 NF-κ b結合のほぼ同一のパターンは、KLF2過剰発現細胞で観察された。 KLF2は、NF-κ bを介した転写活性化に影響を与えることができるかどうかを評価するために、遺伝子レポーターアッセイを実施した。 図に示すように。 図3D、nf-κ bルシフェラーゼレポータープラスミドとp65のトランスフェクションは、≥11倍によって転写活性を誘導した。 この誘導は強くKLF2がNF-κ b転写活性を阻害することを示す、KLF2の存在下で減少した。 ＫＬＦ２の同様の効果が、ＡＰ−１経路について観察された（図１ ０Ａ）。 ＰＮＡＳのウェブサイト上で支援情報として公開されている、図５Ａ〜Ｃに示されている）。
KLF2はNF-κ b転写活性を阻害する。 （ＡおよびＢ）ＫＬＦ２は、ＮＦ−κ ｂ経路の成分の発現を変化させない。 THP-1細胞をアデノウイルス（EVまたはKLF2）に感染させ、LPSで30分、1時間、または2時間刺激し、核および細胞質抽出物を用いたウェスタンブロット分析によ （Ｃ）ＫＬＦ２はＮＦ−κ Ｂ ＤＮＡ結合に影響しない。 THP-1細胞は、アデノウイルス（EVまたはKLF2）に感染し、1時間のLPSで刺激し、核抽出物は、ゲルシフトアッセイのために使用されました。 ＮＦ−κ ｂ帯域は矢印で示される。 特異性は、競争および超シフト研究によって検証された。 （Ｄ）ＫＬＦ２は、ＮＦ−κ Ｂコンカテマーのｐ６ ５媒介性トランス活性化を阻害する。 一過性トランスフェクション研究は、示された構築物とRAW264.7細胞で行われました。 これらの実験を３回実施し、少なくとも３回繰り返した。
統一メカニズムとしてKLF2によるコアクチベーター CBP関連因子（PCAF）の募集。
をまとめると、図中の結果が得られる。 図３は、ＫＬＦ２が、これらの因子のＤＮＡ結合に対する効果とは無関係に、ＮＦ−κ Ｂ媒介性トランス活性化を阻害し得ることを示す。 一つの可能なメカニズムは、重要なコアクチベーターの募集です。 例えば、最適なＮＦ−κ Ｂ結合は、ステロイド受容体コアクチベーター（ＳＲＣ）−１、ＰＣＡＦ、およびｐ３ ０ ０／ＣＢＰのようないくつかの重要なコアクチベーターとの相互作用を必要とする。 ＫＬＦ２は、これらの因子の１つまたは複数と相互作用し、それらをＮＦ−κ Ｂからリクルートし、結果として、ＮＦ−κ Ｂ媒介転写活性を低下させ得る。
NF-κ B転写活性のKLF2媒介阻害におけるPCAFの役割を決定するために、我々は外因性PCAFを用いた共感染研究を行った。 PCAFのトランスフェクション（ただしp300ではない; ｎｆ−κ ＢコンカテマーのＫＬＦ２媒介抑制を有意に救助した（図１ ０Ｂ）。 4A）。 部分的な救助はまた、ＡＰ−１転写活性を阻害するＫＬＦ２の能力についても観察された（図１ ０Ａ）。 5D）。 KLF2とPCAFが相互作用するかどうかを決定するために、我々はGSTプルダウンと共免疫沈降アッセイを行った。 In vitro転写産物および翻訳産物を用いて、本発明者らは、KLF2およびPCAFが無細胞系において直接相互作用することができることを見出した（図10B）。 4B）。 PCAFがIN vivoでKLF2に結合するかどうかを知るために、我々はCOS-7細胞でKLF2（ヘマグルチニンタグ付き）とPCAF（フラグタグ付き）を過剰発現しました。 抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降に続いて抗ヘマグルチニン抗体によるウェスタンブロット法により、ＫＬＦ２が細胞中でＰＣＡＦと結合することが示された（図１）。 4C）。
KLF2はPCAFと直接対話する。 （Ａ）ＰＣＡＦ過剰発現は、ＮＦ−κ Ｂ転写活性のＫＬＦ２媒介阻害を救助する。 示されたプラスミドを用いた一過性トランスフェクション研究は、以前に記載されたようにRAW264.7細胞で行われた（n=グループあたり9-12）。 （Ｂ）ＫＬＦ２は、無細胞系においてＰＣＡＦと相互作用する。 結合実験は、ＰＣＡＦおよびＧＳＴ−ＫＬＦ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳産物（ＴＮＴ）を使用することによって行った。 オートラジオグラフデータ（上）とゲルのクーマシー染色（下）は、負荷量とPCAFタンパク質（γ）を示しています。 入力はPCAF-TNTの2％です。 （Ｃ）ＫＬＦ２およびＰＣＡＦは、細胞内で相互作用する。 示された構築物でＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトし、免疫沈降研究を、材料および方法に記載されているように行った。 (D)KLF2はPCAFの募集を削減します。 ＴＨＰ−１細胞をＡ ｄ−ＫＬＦ２またはＥＶ含有ウイルスに感染させ、ＬＰＳで刺激し、ＣＯＸ−２プロモーター上の示された因子についてＣｈｉｐアッセイを行った（詳細については、材料およ
観察された効果の根底にあるメカニズムがin vivoで動作しているかどうかを決定するために、我々はクロマチン免疫沈降（ChIP）研究を行った。 予想されるように、ＴＨＰ−１細胞のＬＰＳ刺激は、Ｐ６ ５およびＰＣＡＦのＣＯＸ−２プロモーターへの動員をもたらした（図１ ０Ｂ）。 4D）。 さらに、hh3およびHH4の付随するアセチル化が観察された。 しかしながら、ＫＬＦ２過剰発現の文脈では、ＰＣＡＦ動員およびヒストンアセチル化は、両方とも強く減衰される（図１ ０Ａ）。 4D）。 私たちのゲルシフトアッセイと一致して、KLF2の有意な効果はp65募集に観察されませんでした。
