Discussion
Kの連続培養中に高レベルのプロテアーゼ活性の観察された産生を産生する。 セデンタリウスは、アゾカセイン、インスリンのβ鎖、ヒトカルスおよび未処理のカルスから抽出されたケラチンに対して活性であった二つのプロテアーゼ、P1およびP2の精製を容易にした。 基質範囲，最適温度およびｐ ｈおよびプロテアーゼ阻害剤に対する感受性を含むこれらの酵素の一般的な特性は，それらが生化学的に類似しており，アルカリセリンプロテアーゼファミリーに属する可能性が高いことを示唆した。 これらのプロテアーゼは、多種多様な微生物によって産生され、エンドペプチダーゼとして作用する（Ｒａｏ ｅ ｔ ａ ｌ． 1998).
しかし、この酵素をケラチナーゼに分類できるかどうかは議論の余地がある。 ケラチナーゼは、定義により、純粋な天然ケラチンを加水分解することができるべきである。 しかし、ケラチンの抽出は、非ケラチンタンパク質からそれを分離するために変性剤による事前処理によってのみ達成することができる。 ボールミリングのような機械的処理は、ジスルフィド結合の切断をもたらし、タンパク質をケラチナーゼとして分類されないトリプシンおよびプロテイナーゼKなどのプロテアーゼによるタンパク質分解消化の影響を受けやすくする（Noval and Nickerson1959）。 同様に、加熱がケラチン変性を引き起こす可能性があるため、ケラチナーゼアッセイにおける加熱滅菌基質の使用も批判されている。
本研究では細かく粉砕したカルスを酵素基質として使用したが、培養上清液は無傷のカルス片に対して活性であった。 したがって、２つのプロテアーゼが厳密にはケラチナーゼではなくても、それらはｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトカルスを分解し、これがｉｎ ｖｉｖｏでも起こるといういくつかの証拠 1987).
プロテアーゼは、還元ケラチンに対する活性の結果としてケラチナーゼに分類されており、その場合、還元剤は酵素アッセイ混合物に添加されるか、ケラチン抽出中に使用されている。 皮膚細菌の範囲の角質溶解活性は、基質として”天然”ケラチンを用いて研究されているが、還元剤、ジチオトレイトール（DTT）は、アッセイ混合物に含まれていた。 例えば、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの見かけのケラチナーゼ活性をＤＴＴの非存在下で研究した場合、活性は検出されなかった（Ｍｉｋｘおよびｄ Ｅ Ｊｏｎｇ１ ９ ８ ７）。 同様に、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ由来のセリンプロテアーゼは、トリス−Ｈｃｌおよびβ−メルカプトエタノール中の８ｍｏｌ ｌ−１尿素でヒトの足底の角質層から抽出されたケラチンを分解した（Ｈａｔｔｏｒｉ ｅ ｔ ａ ｌ． 1984). 本研究では、p1とP2は、尿素とβ‐メルカプトエタノールでヒト足カルスから抽出されたケラチンを加水分解したが、重要なのは、未処理のカルスを分解す
角質層とヒトカルスは、ケラチンが主要な成分である複雑で安定した構造です。 ケラチンには30個のヒト遺伝子があり、そのうち18個が皮膚に発現されている（Fuchs1995）。 ケラチンデータベースの要約は、すべてのケラチンがプロテアーゼの潜在的な切断部位を有し、Asp‐ArgおよびGly‐Argが最も一般的であることを示している。 ケラチンフィラメントが最初にこれらの場所で壊れている場合、これらの小さな単位の徐々の分解は、ヒトカルスから抽出されたケラチンに対するプロテアーゼ攻撃の分析によって示されるように、ペプチドフラグメントのサイズ範囲を生成する、二次切断部位で発生する可能性があります。 その結果を図に示す。 図３Ｂは、Ｐ２のカルス分解活性のための２つのｐＨ最適値を示す。 一つの可能な説明は、サンプル中に二つの酵素があるということです。 これは、銀染色を伴うＰＡＧＥによって示されるように、使用された酵素試料が高度に精製されたために起こりそうにないと思われる（図１ ０参照）。 1、レーン6）。 ページ上の非常に類似した移動度を有する精製されたP2サンプル中の二つのカルス分解酵素の可能性を排除することはできません。 しかし、同じサンプルは、アゾカセインアッセイと同じバッファーを使用してテストされ、唯一のpH最適は、pH10·2で検出されました。 別の説明は、異なるpHsでの複雑なカルス基質/酵素相互作用は、酵素活性と基質の微妙な立体配座変化のバランスであり、これは二重のpH最適化をもたらすということである。
この調査により、k.sedentariusはカルス分解活性を有する二つの細胞外プロテアーゼを産生することが示されている。 それらの相対的な分子サイズ、それらのpiに関する基本的な情報が決定されている。 しかし、これらのin vitro実験で使用される天然の基質は、水に不溶性のポリマーの複雑な混合物であったため、従来の酵素速度論的研究に対処することが 800ミリモル1-1塩の存在下でのP2の酵素活性の増加は、人の運動速度および環境温度によって決定されるエクリン腺活性に応じて塩濃度が変化するヒト皮膚上の微生物の生存に関連している可能性がある。 塩化ナトリウムの効果にかかわるメカニズムは演説されませんでした。 塩化ナトリウムは酵素活性部位の基質特異的切断部位へのアクセスを改善するために酵素および基質の三次構造またはその両方に影響を与え得ることを暫定的に示唆した。
観察された結果の最も簡単な説明は、K.sedentariusの培養上清には、カルス中に存在するヒトケラチンを可溶化する二つのカルス分解酵素、セリンプロテアーゼ Kとすることが可能である。 セデンタリウスは一つの遺伝子によってコードされる一つのプロテアーゼを産生し、その自己触媒活性または他のプロテアーゼ活性は異なる分子量の二つの酵素を産生する。 あるいは、二つの独立した密接に関連する酵素をコードする二つの遺伝子がある。 後者の仮説は、以前の研究によって支持されている（Holland et al. 1992). 異なる希釈速度で定常状態でのＫ．ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓの連続培養からの試料をページ上でアッセイし，カゼインで重ねたところ，二つの酵素，一つの構成的および他の酵素が低希釈速度で高濃度で検出されたことが示された。 重要なことに、μ ｍａｘ付近の希釈速度では、それは検出されなかった。 P1（21残基）とP2（15残基）ポリペプチドのN末端アミノ酸配列の決定は、それらが全く異なることを示した。 この結果は、連続培養実験からの情報と一緒に取られ、酵素が独立してコードされていることを示唆するであろう。
この調査の結果は、k.sedentariusの特定のプロテアーゼがピット状角化分解のカルス特性の分解を説明できるという仮説を強化している。 これまでの証拠はまた、二つのプロテアーゼが関与しており、それらが皮膚部位のpH、pHで活性であることを示唆している6·3-6·9 （Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅ ｔ ａ ｌ． 1988). ヒトカルスを基質として用いたにもかかわらず，ｉｎｖｉｔｒｏ実験から得られた結果のｉｎｖｉｖｏ環境への解釈は疑問視することができる。 理想的には、人間の皮のバイオプシーは正常な、凹んだ皮の区域を含んで取られるべきです。 プロテアーゼの存在および位置または不在は、プロテアーゼおよびK.sedentariusのプローブとしてモノクローナル抗体を用いた組織学的技術によって決定され得る。 しかし、倫理的な承認は、代表的な数の人々から、必要な場所、足の耐荷重部位からの生検のために与えられないであろう。 ケラチンを分解するプロテアーゼの産生機構によるピット角化症におけるk.sedentariusの関与は正式に証明されていない。 しかし、仮説に反論する証拠はなく、ここで提示された結果によってその信憑性が強化されている。 強いin vitro証拠は、k.sedentariusと条件ピット角質溶解でその細胞外カルス分解酵素を関与提示されています。 正常な皮膚pHsおよび表面水和では、これらの酵素の産生および活性は低く、P1はより活性である。 閉塞のそして悪いhygeineの環境条件の下で、皮pHは中立性にそしてわずかに上で動きます。 これらの条件はP2を支持する。 どちらの酵素もおそらく掃気酵素であり、K.sedentariusは炭素源と窒素源、小さなペプチド、居住者と不溶性の複合ポリマー、ケラチンを得ることができる。 現時点では、これらの酵素の産生の調節は、in vivoでのカルス分解に対するそれらの相対的な寄与と同様に、未知である。 臨床的意味に加えて、ケラチン分解プロテアーゼは、家禽および皮革産業からのケラチン廃棄物の分解を含む多くの工業プロセスにおいて有用であるため、商業部門にとってかなりの価値を有する（Shih1993;Onifade et al. 1998). Kの高いケラチン分解活性。 他の多くのプロテアーゼと比較して、比較的低い温度およびpHでのsedentariusプロテアーゼは、バイオテクノロジー産業におけるこれらの酵素の潜在的な適用を示
