Lactobacillus fermentum TCUESC01の機能プロファイル評価：ココア発酵中に単離された新しい潜在的なプロバイオティクス株

要約

腸内プロバイオティクス細菌の使用は、食品業界では非常に一般的であり、この分野の研究の大部分の焦点となっている。 しかし、近年、腸外微生物の研究は、プロバイオティクスとしてよく知られている可能性のために大幅に増加しています。 そこで、発酵ココアから抽出されたLactobacillus fermentum（TCUESC01）の株を研究しました。 まず、この株の成長に及ぼすpHの影響を調べ、ヒト消化管のものと同様の条件下での生存を研究した。 L.fermentum TCUESC01は、人間の胃や腸を模倣する条件に対する耐性を示し、pH5とpH7の間でよく成長した。 次に、l.fermentum TCUESC01をミルク溶液中で4℃で保存し、28日間よく生存することを見出した。 最後に、我々は、多数の抗生物質に対するこの株の感受性と自己凝集する傾向を測定した。 L. fermentum TCUESC01は、有意な自己凝集だけでなく、テストされた抗生物質の大部分に対する感受性を示した。 全体的に、我々の調査結果は、食物プロバイオティクスとしてのこの腸外細菌の潜在的な使用を支持する。

1. はじめに

新しいプロバイオティクスの探索は、微生物の各株が異なる特性を有し、人間の健康に独特の影響を及ぼす可能性があるという知識に 歴史的に、プロバイオティクス製品の乳酸菌は、宿主の特異性のためにヒトから供給されなければならないと考えられていました。 しかし，発酵乳糖含有食品または発酵野菜から単離された腸外微生物も有望なプロバイオティクス効果を示す。 我々の研究室からの予備的証拠は、高品質のココアの発酵に由来する乳酸菌株がプロバイオティクス特性を示すことを示している：彼らは、組織学的損傷を減少させ、炎症性サイトカインの全身濃度を低下させ、大腸炎のin vivo実験モデルにおける血清IgAレベルを増加させる。 しかし、市販品におけるこれらの株の可能性のある使用は、国際機関によって推奨される一連の試験に依存する。 国連食糧農業機関（FAO）と世界保健機関（WHO）によると、潜在的なプロバイオティクス株は、胃腸輸送中の抵抗性および貯蔵中の安定性を含む機能的および技術的特性について評価されるべきである。 そこで、高品質のカカオの発酵中に単離されたLactobacillus fermentum株TCUESC01の機能特性と安全性を評価しました。

2. 材料および方法

2.1. 微生物および生育条件

Lactobacillus fermentum TCUESC01株（受託番号KU244478、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478））は、lactobacillus MRSブロス（1％ペプトン、0.8％肉抽出物、0.4％酵母抽出物、2％グリコース、0.5％酢酸ナトリウム、0.2％リン酸水素二カリウム、0.02％硫酸マグネシウム七水和物、0。０ ２％クエン酸トリアンモニウム塩）（ＨＩＭＥＤＩＡ（登録商標）、Ｉｎｄｉａ）を３ ７℃で１ ８時間保存し、３ ０％グリセロールを含有する１ ０％乳溶液（Ｍｏｌｉｃｏ（登録商標）、Ｂｒａｄｉａｌ）中で−８ ０℃で保存した。

2.2. 様々なpH下での成長および生存率の分析

pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、およびpH9のMRSブロス溶液を、1mol·L−1の塩酸または1mol·L−1の水酸化ナ 試験の前に、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＴＣＵＥＳＣ０ １を１ ８時間培養し、次いで生理食塩水で希釈した（０．の光学密度（ＯＤ）を６ ０ ０ｎｍで測定したとき（ＯＤ６ ０ ０＝０.３）、光学密度（ＯＤ）を６ ０ ０ｎｍで測定したとき（ｏｄ６ ０ ０＝０.３）。 試験は、９ ６ウェルのマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））で実施し、各ｐＨで１ ８ ０μ ｌのＭＲＳに、対照として２ ０μ ｌの活性培養物または生理食塩水を接種した。 マイクロプレートを３ ７℃でインキュベートし、６ ０ ０ｎｍでのＯＤを、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）、Ｖｅｒｓａｍａｘ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて１ ０時間毎に測定した。 並行して、各ｐＨから１時間毎に試料を採取し、ＭＲＳ寒天上にめっきし、３ ７℃で嫌気性条件下でインキュベートして、細胞生存率を試験した。

2.3. 胃腸条件に対するIn Vitro耐性

細菌を、40mLのMRSブロス中で37℃で一晩培養し、生理食塩水で洗浄し、20mLの10％乳溶液に接種した。 ５のｐＨに達するまでミルク発酵を進行させ、その時点で、細菌を連続希釈およびＭＲＳ寒天上でのめっきによって計数した（ＣＦＵ＊ｍＬ−１）。 さらに、ペプシン（3g/L）を用いた生理食塩水（pH2.5）中で連続希釈を行い、続いて37℃で1.5時間インキュベーションした。 細菌を２サイクルの遠心分離（５ ０ ０ ０×ｇ／１ ０分）によって洗浄し、生理食塩水中で再懸濁した後、２ ０ｍＬの１％ブタ胆汁中にｐＨ８． 細菌数（CFU·mL−1）は、各インキュベーション相の後に37℃で嫌気性条件下でMRS寒天中の細菌溶液を48時間めっきすることによって決定された。

2.4. 酸性化乳中での低温保存中の生存＜９ １ ０ ９＞＜６ ２ ９ ６＞Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ株ＴＣＵＥＳＣ０ １をＭＲＳブロス中で培養し、次いで遠心分離（５ ０ ０ ０×ｇ／１ ０分）により回収した。 次いで、細菌を生理食塩水中での再懸濁によって洗浄し、遠心分離によって再びペレット化した。 培養物を、乳酸でpH4.5に酸性化された10％の非脂肪乳の滅菌溶液（Synth（登録商標）、ブラジル）に接種した。 乳酸溶液を４℃で冷蔵し、コロニー形成単位（ＣＦＵ＊ｍｌ−１）を連続希釈し、０、７、１ ４、２ １、および２ ８日にＭＲＳ寒天上でめっきすることによって計数した。 株の生存率は、100％の生存率を有すると考えられていたゼロ時点に関連して決定された。

2.5. 自己凝集の分析＜９ １ ０ ９＞＜６ ２ ９ ６＞ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＴＣＵＥＳＣ０ １を、２ ０ｍＬのＭＲＳブロス中で３ ７℃で一晩培養した。細菌ペレットを回収し、生理食塩水に６ ０ ０ｎｍ（ＯＤ６ ０ ０＝０． 自己凝集のためのL.fermentum TCUESC01の容量は、37℃で懸濁液をインキュベートすることによってテストされ、ODは5時間毎時監視されました。 示された結果は、三つの実験からの平均プラス/マイナスの標準偏差であった。

2.6. 抗生物質感受性試験

L.fermentum TCUESC01を18時間MRSブロスで37℃で成長させ、生理食塩水でMcFarlandスケールで0.5に希釈した。 抗生物質ディスクをMueller-Hinton寒天プレート上に置き、それに100μ lの活性細菌懸濁液を接種した。 次いで、プレートを嫌気性条件下で３ ７℃で２ ４時間インキュベートした。 ディスクの周りの阻害のゾーンを測定し、細菌は、表1に概説されている基準に基づいて、耐性（）、適度に感受性（MS）、または感受性（）として分類された。 感受性試験で使用した抗生物質ディスクは、アモキシシリン（ＡＭＯ、ＬＡＢＯＲＣＬＩＮ（登録商標）、ブラジル、１ ０μ ｇ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ、ＬＡＢＯＲＣＬＩＮ、ブラジル、５μ ｇ）、アミカシン（ＡＭＩ、ＣＥＣＯＮ（登録商標）、ブラジ３ ０Μ Ｇ）、ストレプトマイシン（ＥＳＴ、ｌａｂｏｒｃｌｉｎ、ｂｒａｄｉａｌ、１ ０Μ Ｇ）、エリスロマイシン（ＥＲＩ、ＣＥＣＯＮ、ｂｒａｄｉａｌ、１ ５Μ Ｇ）、テトラサイクリン（ＴＥＴ、Ｓｅｎｓｉｆａｒ、ｂｒａｄｉａｌ、３ ０μ ｇ）、イミペネム（ＩＰＭ、ＣＥＣＯＮ、ｂｒａｄｉａｌ、３ ０μ ｇ）、フェノキシエタノール（ＳＵＬ、ｎｅｗｐｒｏｖ（登録商標）、ＢＲＡＤＩＡＬ、３ ０μ Ｇ）、, セファロチン(CFL,LABORCLIN,Brazil,30μ g)、ゲンタマイシン(GEN,CECON,Brazil,10μ g)、セフォタキシム(CTX,SENSIFAR,Brazil,30μ g)、コトリモキサゾール(trimethoprim and sulfamethoxazole)(SUT,SENSIFAR,Brazil,25μ g)、クロラムフェニコール(CLOTS,SENSIFAR,Brazil,30μ g)、クリンダマイシン(CLI,CECON,Brazil,30μ g)、２μ ｇ）、ペニシリンｇ（ｐｅｎ１ ０、ＣＥＣＯＮ、ブラジル、１ ０Μ Ｇ）、およびセフォキシチン（ｃｆｏ、ＬＡＢＯＲＣＬＩＮ、ブラジル、３ ０μ ｇ）。

2.7. 統計分析

平均および標準偏差の計算、分散分析、Tukeyの多重比較検定、およびすべての統計分析は、GraphPad®Prism5.0ソフトウェアプログラムを使用して行われました。 すべてのグラフは、GraphPad Prism5.0プログラムを使用しても作成されました。

3. 結果

3.1. L.fermentum TCUESC01の成長と生存率に対するpHの影響

L.fermentum TCUESC01は、pH5、pH6、およびpH7の培地中で成長することができました（図1）。 しかし、このpH範囲外では成長は観察されなかった(図1)。

(a)
(a)
(a))

(b))

()

(d)

(イン))

(f）＜5968＞＜7739＞（)

(g）＜8127＞＜7739＞（エン)

()

（および)

(a)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)(f)
(f)(g)
(g)
(h)
(i)

図1

異なるpHで0〜10時間の培養期間におけるLactobacillus fermentum TCUESC01の成長：（a）pHを変更しないMRSの成長（pH6.52）;（b）pH2のMRSの成長;（c）pH3のMRSの成長;（d）pH4のMRSの成長;（e）pH5のMRSの成長;（f）pH6のMRSの成長; （ｇ）ｐＨ７のＭＲＳでの成長；（ｈ）ｐＨ８のＭＲＳでの成長；（ｉ）ｐＨ９のＭＲＳでの成長。 図の各点は、3つの実験からの平均と標準偏差を表します。

3.2. L.fermentum TCUESC01の胃腸条件に対する耐性In Vitro

l.fermentum TCUESC01の胃腸通過に対する耐性は、ヒトの胃腸管を模倣するように設計された条件下で評価された（図2）。 細菌溶液を、10％乳溶液中で8.7×108CFU·mL−1の濃度に成長させた。 胃液をシミュレートするためにpH2.5で1.5時間のペプシンを含む溶液に細菌を提出した後、我々は1.23×108CFU·mL−1に細菌濃度の統計的に有意な減少（）を観察 生理食塩水で洗浄した後、細菌を、腸内環境をシミュレートするために、pH8.0で45分間、1％ブタ胆汁の溶液に供した。 この処理に続いて、細菌数（3.6×107CFU·mL−1）における約1logの減少を観察した。 シミュレートされた腸液中のインキュベーション中の細菌数の減少は統計的に有意ではなかった。

図2

シミュレートされた消化管通過中のLactobacillus fermentum TCUESC01の生存。 ミルクの発酵の後の”発酵させたミルク”;塩pH2.5+ペプシンの道の後の”模倣された胃ジュース”;牛の胆汁1%の道の後の”模倣された腸ジュース”。 グラフ上の各点は、3つの実験の平均偏差と標準偏差を表します。 “発酵乳”に関連した統計的に有意な減少（）。”

3.3. L.fermentum TCUESC01の商業貯蔵条件下での生存

貯蔵中の生存を評価するために、L.fermentum細菌を4℃で28日間冷蔵し、乳酸でpH4.5に酸性化した無菌の10％非脂肪乳で28日間冷蔵した（図3）。 細菌株は、最初は3.6×109CFU·mL−1の濃度であったが、保存の7日後に、細菌数における約1logの統計的に有意な減少を観察した。 7日目から21日目まで、4.3×108CFU·mL−1から9.0×108CFU·mL−1までの予想外の成長があった。 28日目までに、細菌濃度は2.83×108CFU·mL−1に減少していた。

図3

発酵乳中のLactobacillus fermentum TCUESC01の0日から28日、4℃での生存それぞれの点は、三つの実験の平均と標準偏差を表しています。 “a”：ゼロ日（）に対する統計的に有意な差、”b”：14日に対する統計的に有意な差、”c”: 21日目との関係で統計的に有意な差。

3.4. L.fermentum TCUESC01

の自己凝集細菌は、in vitro培養の五時間までますます凝集し、その時点で最大70.19±1.78％の凝集が観察された（図4）。 しかし、パーセント集計の時間ごとの増加は、実験の第三時間まで統計的に有意であった（）。

図4

Lactobacillus fermentum TCUESC01の自己凝集の割合は、MRSブロスにおける1時間から5時間の培養から37℃で評価されました。”a”：1時間の凝集に関連して統計的に有意な差、”b”：2時間の凝集に関連して統計的に有意な差、。 各点は、3回の実験の平均と標準偏差を表します。

3.5. L.fermentum TCUESC01の抗生物質に対する感受性

この株L.fermentum TCUESC01。 fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. ｆｅｒｍｅｎｔｕｍｔｃｕｅｓｃ０ １はアモキシシリン，アモキシシリンおよびクラブラン酸，ペニシリンＧ，β-ラクタムセフォタキシムおよびセファロチン，アミノグリコシドアミカシンおよびゲンタマイシン，リンコサミドクリンダマイシン，カルバペネムイミペネム，マクロライドアジスロマイシンおよびエリスロマイシン，フェニコールクロラムフェニコールおよびテトラサイクリンに感受性であった。 ストレプトマイシンにも適度に感受性であった。

4. ディスカッション

FAOとWHOによって確立されたガイドラインは、食品マトリックスでの使用を提案する前に、細菌の機能的特性と安全性を分析す 我々は最初に成長し、異なるpHで生き残るために乳酸菌のこの種の能力を評価し、それが唯一のpH5からpH7までの範囲で成長を示したが、それは10-h 研究では、胃が空であるときの胃のpHに広い変動性が示されており、平均値はpH4よりも低い。 腸の環境はより安定して、評価される腸の地域によってpH6とpH8の間で、変わります。 したがって、この乳酸菌は、pH2.5以下で増殖または生存する能力を示していないにもかかわらず、腸のpH範囲で生存可能なままであり、したがって、その 我々のデータと一致して、Lactobacillus plantarum（ST194BZ、ST414BZ、およびST664BZ）、Lactobacillus rhamnosus（ST461BZ、ST462BZ）、およびLactobacillus paracasei（ST242BZ、ST284BZ）は、バルカン半島から一般的に消費される発酵飲料（Boza）から単離された10時間のpH5とpH7の間のインキュベーションの間に良好な成長速度を示した。 ソルガムの飲み物、L.から隔離されるl plantarum423。 ブタ回腸から単離されたplantarum241、サラミから単離されたL.curvatus DF38、およびLactococcus lactis ssp。 ヒト膣分泌物から単離されたラクティスHV219はまた、同様の実験でpH5とpH6.5の間の成長を示した。 全体的に、我々の結果は、L.fermentum TCUESC01は、他の潜在的な腸外プロバイオティクス細菌と同様の成長とpH抵抗性を持っていることを示しています。 さらに、2.5未満のpHレベルに対する菌株の感受性は、マイクロカプセル化のような細菌を保護する方法の使用によって克服することができる。 我々の結果は、明確に酸性特性を有する食品、例えば、チーズ、ジュース、および発酵乳中のプロバイオティクス添加剤として、この株の潜在的な適用をサポートしています。

胃腸環境は多くの細菌にとって敵対的であり、酸性度、消化酵素、胆道塩などの様々なストレス要因が腸への輸送中の生存に悪影響を及ぼす可能性があ 本研究の乳酸菌は、離散的な定量的減少を示したが、胃および腸の条件下で実行可能なままであり、ヒトの腸（0.3％）で見つかった胆汁の濃度に抵抗した。 我々のデータと同様に、Kaushik et al。 Lactobacillus plantarum Lp9は、胃を模倣する条件（pH2）に曝されたときに初期濃度から約0.5log、腸を模倣する条件に曝されたときに1log減少したことが観察された。 別の研究では、L. チーズから単離されたrhamnosus VT1/1は、低pH条件下で約2logの濃度の減少（pH3）と1logの濃度の減少を示したpH7でインキュベートしたとき2％胆道塩の存在下で。 我々の結果は、L.fermentumが胃腸系を通って移動し、107CFU·g−1（またはCFU·mL−1）以上の濃度で生き残ることができることを示唆しており、以前の研究は相互作用および/ま

食品マトリックスは、微生物の貯蔵中の生存率にも影響を及ぼす要因でもあります。 酸性化ミルク中のL.fermentum TCUESC01の長期生存をテストする際に、我々は7日目から21日目にわずかな増加に続いて細菌数の初期減少を観察した。 この成長は、乳酸溶液中での細菌代謝の継続によって説明することができるが、低温のために減少した速度で説明することができる。 Donkor et al. また、4℃での貯蔵中のプロバイオティクス細菌、特にLactobacillus delbrueckii sspの定量的変化を観察した。 bulgaricus Lb1466は、低温貯蔵の1日目から7日目までの14ログの成長を示した。 別の研究では、発酵乳に貯蔵されたL.plantarumは、約28日間の貯蔵中に1logによって細胞濃度を4℃で有意に減少させた。 L.fermentumは、貯蔵の最終日までに初期濃度から1logの減少を示していたが、その濃度は乳酸溶液の有効期限で平均を上回っていた。 同様に、衛生監視のための国家機関（ANVISA）の勧告に基づいて、L. fermentum TCUESC01は、発酵乳と同様の食品マトリックスに導入され、製品の有効期限まで適切な濃度で生き残ることができます。

自己凝集する能力を持つ微生物は腸内に長く残り、上皮細胞や宿主免疫系との相互作用が良好になります。 L.fermentum TCUESC01株は、私たちの5-h試験で自動凝集のための上昇した容量を示した。 この結果は、Beganovićらによって報告された結果よりも高い。 、whoはL.fermentum A8が60.9±3を持っていたことを示した。5時間のインキュベーション後の91％の自己凝集、またはBaoらによって報告されたものである。 、whoは28％未満の10株のL.fermentum20時間インキュベーション後の自己凝集を示した。 これらの結果に基づいて，Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍはよく凝集し，摂取すればヒトの腸内環境に長期間持続する可能性が高い。

最後に、我々は様々な抗生物質に対するTCUESC01の感受性を評価した。 抗生物質感受性の知識は、我々は三つの重要な要因を考慮するときに非常に重要です: 乳酸菌による感染のまれな可能性、天然微生物への耐性遺伝子の水平移動のリスク、およびプロバイオティクス細菌と抗生物質治療との関連。 L.fermentum TCUESC01は、核酸合成阻害剤（ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、スルホンアミド、およびコトリモキサゾール）と二つの細胞壁合成阻害剤（バンコマイシンとセフォキシン）を除いて、抗生物質の大部分に感受性を示した。 これらの結果は、Kirtzalidouらによって発表されたデータを裏付けている。 ラクトバチルスsspの74株について。 ヒトの糞便から単離され、そのうち94。5％の株はアミカシンに耐性があり、すべてがカナマイシンとシプロフロキサシンに耐性があり、84.7％の株はバンコマイシンに耐性があり、1.6％の株はセファロチンに耐性があり、8.5％の株はバシトラシンに耐性があった。 一般に，乳酸菌はキノロン，トリメトプリム，スルホンアミド，バンコマイシン，および核酸阻害剤の大部分に対して固有の耐性を示し，アミノグリコシドを除いて蛋白質合成阻害剤に対して感受性を示した。 ここで観察された抗生物質に対する耐性は、公開された研究から明らかなように属に固有であり、したがって水平遺伝子導入はまれであることは 要約すると、L.fermentum TCUESC01の耐性プロファイルは、核酸合成を阻害することによって働く抗生物質と一緒に使用する可能性をサポートしています。

5. 結論

ココア発酵中に単離されたextraintestinal株であるにもかかわらず、L.fermentum TCUESC01は、食品への応用のためのプロバイオティクスとして強い可能性を示しています。 従ってそれは広いpHスペクトルを渡って実行可能に残り、異なったタイプの食糧の包含のために適しています。 冷やされていた乳製品で貯えられたとき、それはプロダクト有効期限までの確認された国民および国際機関によって推薦されるレベルの上の生 胃腸通過を模倣する条件下では、それはまた、プロバイオティクスの可能性の維持に十分な量で生存する。 腸内の予測された行動の点では、L.fermentum TCUESC01は自己凝集する強い傾向を示しています。 最後に、この株は、薬物療法と一緒にその使用を可能にする抗生物質感受性および耐性プロファイルを示す。 一緒に取られて、これらの特徴はL.fermentum TCUESC01に安全なprobiotic食品添加物として大きい潜在性があることを提案する。

利益相反

著者は、利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

この研究は、Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia（FAPESB）からの助成金によって支援されました。 Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)とCoordinação de Aperfeiçoamento De personnels de niveau Superior(CAPES)は、いくつかの著者のための生産性と大学院フェローシップを提供しました。