ゼブラフィッシュの維持とストック:確立されたプロトコール30に従ってゼブラフィッシュ(Danio rerio)を飼育し、ステージングした。使用したトランスジェニック系は、Ｔｇ（ｋｄｒ−ｌ：ｒａｓ−ＭＣｈｅｒｒｙ）ｓ９ １ ６ ３ １、Ｔｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＥＧＦＰ）ｚｆ４ ９ ５ ３ ２、ｔｇ（ｆｌｉ１：ｍｙｒ−ＥＧＦＰ）ｎｃｖ２ ３ ３、Ｔｇ（ｆｌｉ１：ｍｙｒ−ＭＣｈｅｒｒｙ）ｎｃｖ１ ３ ４、Ｔｇ（ｆｌｉ１：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＭＣｈｅｒｒｙ）ｎｃｖ７ ３ ３、Ｔｇ（ｆｌｉ１：ＧＡＬ４ＦＦ）ｕｂｓ３ ７、Ｔｇ（ＵＡＳ）であった。:Ｕｂｓ１ ８ ３ ５、Ｔｇｂａｃ（ｐｄｇｆｒｂ：ＧＦＰ）ｎｃｖ２ ２ ３ ６およびＴｇ（ｋｄｒｌ：ＥＧＦＰ）ｓ８ ４ ３ ３ ７。 すべての動物実験は、理化学研究所神戸支店（IACUC）のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されました。
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド：ゼブラフィッシュmarcksl1a、marcksl1bおよびfscn1aは、NEB®PCR Cloning kitを用いて1dpf胚のcDNAからPCRによってクローニングされた。 本研究で使用された全ての発現構築物は、Ｔｏｌ２Ｋｉｔ３ ８からのプラスミドを用いたＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングおよび／またはＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）クローニングを介して 変異Ｍａｒｃｋｓｌ１ＡおよびＭａｒｃｋｓｌ１Ｂを有するプラスミドを、Ｑ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ）を使用して作製した。 ベクターを含むｓｈｒｎａは、修飾されたｐＥＧＦＰ−Ｕ６ｖｅｃｔｏｒ３ ９のＵ６プロモーターの下流のＥｃｏｒｉ部位とＰｍｅｉ部位との間のｓｈＲＮＡ配列の連結によって構築された（Ｚｕｏｓｈａｎｇ Ｘ Ｕ、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃１ ９ ７ ９ ９からの贈り物）。 ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１の標的配列は、５’−ＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧ−３’である。 スクランブルされたｓｈＲＮＡ配列５’−ＧＡＧＴＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧ−３’は、ＭＡＲＣＫＳＬ１ｓｈＲＮＡの不一致配列（下線付き）として設計された。 マウスＭａｒｃｋｓｌ１、Ｍａｒｃｋｓｌ１−Ｓ１ ２ ０Ａ／Ｔ１ ４ ８Ａ／Ｔ１ ８ ３Ａ（Ｍａｒｃｋｓｌ１−Ａ Ａ Ａ）およびＭａｒｃｋｓｌ１−Ｓ１ ２ ０Ｄ／Ｔ１ ４ ８Ｄ／Ｔ１ ８ ３Ｄ（Ｍａｒｃｋｓｌ１−ＤＤＤ）を含むベクターは、Ｅｌｅａｎｏｒ Ｔ． 本研究で使用されるプラスミドおよびプライマーに関する詳細な情報は、それぞれ補足表1および2に見出すことができる。
RNA単離およびcDNA合成: ＴＲＩ試薬（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）およびＤｉｒｅｃｔ−ＺｏｌＴＭ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して全ＲＮＡを単離し、製造業者のプロトコールに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを合成した。
構造体とトランスジェニックゼブラフィッシュ系統のモザイク発現: Ｔｏｌ２ベースの発現構築物（５〜１ ０ｐｇ）を、Ｎｏｔｉ−線形化ＰＣＳ−ＴＰベクター（Ｋｏｉｐｉ Ｋａｋａｋａｙａｍａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ ｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊａｐａｎからの贈り物）から転写されたＴｏｌ２トランスポザーゼｍＲＮＡ５ ０ｐｇと共に、Ｍｍｅｓｓａｇｅ Ｍ Ｍａｃｈｉｎｅ ＳＰ６ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１細胞期ゼブラフィッシュ胚に同時注入した。 導入遺伝子のモザイク発現のために、胚は、注射後1または2dpfで分析した。 Ｔｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：ｍｙｌ９ｂ−ＥＧＦＰ）ｒｋ２ ５およびＴｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：ＥＧＦＰ−Ｐｌｃ１Δ Ｐ Ｈ）ｒｋ２ ６株を生成するために、注入された胚を成体に育て、創設者についてスクリーニングした。
ゼブラフィッシュmarcksl1aおよびmarcksl1b変異体の生成：marcksl1a変異体は、CRISPR/Cas9媒介変異誘発によって生成されました。 第二のエクソンを標的とする単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（補足図１ １Ａ）。 4a)は、クローニング非依存プロトコール40を用いて生成された。 注射の直前にｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を組み立て、室温で５分間インキュベーションした後、２ ０ ０ｐｇのＣａｓ９タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１ ０ ０ｐｇのｓｇＲＮＡを、１細胞期Ｔ Ｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＥＧＦＰ） marcksl1b変異体はTALENを介した変異誘発によって生成されました。 TALENはmarcksl1bの最初のエクソンを標的としている（補足図。 TALエフェクター2.0を使用して設計されています。（https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old）と、ゴールデンゲート方式で組み立てられた。 ＴＡＬＥＮ反復可変ジ残基（Ｒｖｄ）を、Ｒｃｉｓｃｒｉｐｔ−Ｇｏｌｄｙｔａｌｅｎベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にクローニングし、各ＴａｌｅｎのキャップｍＲＮＡを、ｍｍｅｓｓａｇｅ ＭＭａｃｈｉｎｅ Ｔ３キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｓａｃｉ線状発現プラスミドからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した。 一細胞期Ｔｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＥＧＦＰ）ｚｆ４ ９ ５；Ｔｇ（ｋｄｒ−ｌ）:ｒａｓ−ＭＣｈｅｒｒｙ）ｓ９ １ ６胚に、２ ０ ０ｐｇのＲＮＡ（各左右のＴＡＬＥＮ ｍ ＲＮＡ１ ０ ０ｐｇ）をマイクロインジェクションした。 F0創設者は、野生型魚とTALENまたはCRISPR/Cas9注入魚を露交配し、t7エンドヌクレアーゼI（NEB）アッセイ（TALEN注入魚用）またはSanger配列決定（CRISPR/Cas9注入魚用）を使用して2dpfでの突然変異のための子孫をスクリーニングすることによって同定された。 簡単に言えば、ゲノムDNAは、HotSHOT method42を使用して五つの胚のグループから単離され、対応するゲノム領域が増幅されました。 変異は、精製されたＰＣＲ産物の直接配列決定によって評価した。 陽性F0のf1子孫は成人期に上昇し、変異のためのヘテロ接合キャリアは、同じプライマーを使用してフィンクリッピングとルーチンgenotyping PCR解析によっ
marcksl1aにおける六つの変異対立遺伝子およびmarcksl1bにおける五つの変異対立遺伝子がスクリーニング中に同定された（補足図。 13). 対立遺伝子rk23は、アミノ酸51の後にフレームシフトをもたらし、5ミスセンスアミノ酸の後にアミノ酸56で早期停止コドンをもたらす2-nt欠失を 4a、c）。 対立遺伝子rk24は、アミノ酸13の後にフレームシフトをもたらし、4ミスセンスアミノ酸の後にアミノ酸17で早期停止コドンをもたらす5-nt欠失を 4b、d）。 これらの理由から、我々はmarcksl1ark23とmarcksl1brk24がヌル対立遺伝子であると考え、これらの変異体の分析に私たちの調査を焦点を当てました。
ライブイメージング：胚は、0.16mg/mLのトリカインと0.003％フェニルチオ尿素を含むE3培地中の0.8％低溶融アガロース（バイオ-ラッド）にマウントされました。 共焦点ｚ−スタックは、ｚｙｌａ４． 明視野画像をLeica M205FA顕微鏡で取得した。 画像は、Ｆｉｊｉ（ＮＩＨ）を使用して処理した。
レーザーアブレーション：405nmレーザー（Andor）とFRAPPAモジュール（Andor）を使用してレーザーアブレーションを行ったオリンパスIX83/横川CSU-W1共焦点顕微鏡とオリンパスUPLSAPO60x/NA1.2水浸 1000μ sの滞留時間を持つ三つのシーケンシャルレーザーアブレーションは、それぞれ51％のレーザーパワーで適用されました。
微小血管造影：野生型、marcksl1ark23、marcksl1brk24およびmarcksl1ark23;marcksl1brk24胚で微小血管造影を行った。 全てにおいて、2および3dpf胚は、1-2nLデキストランテトラメチルローダミンまたはデキストランフルオレセイン（MW=2000kDa、Invitrogen）を10mg/mLで注入し、すぐに画像化した。 共焦点zスタックは、オリンパスUPLSAPO10×/NA0.4対物レンズで取得しました。 胚全体をカバーするために、いくつかの領域を画像化し、Fiji43のStitchingプラグインを使用してステッチしました。
細胞移植：marcksl1ark23から15-25ドナー細胞のグループ;marcksl1brk24変異胚Tg(kdr-l:ras–mCherry)s916背景は、胚盤葉のランダムな位置から収集し、4.5-6hpfで野生型レシピエント胚 抽出および移植は、ｈｏｒｉｚｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ ｐｕｌｌｅｒ Ｐ−８ ７（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃ Ｏ．)とMF-900microforge(Narishige)とを用いて、滑らかな先端の’スプーン’形状を得た。 移植胚の間に0.5x E2緩衝液でアガロース被覆ペトリ皿に保存されています。 2dpfでは、mCherry陽性Isvと胚は、微小血管造影とイメージングのために選択されました。 合計八つの独立した移植が行われた。＜５ ４ ７ ７＞＜８ ２ ９ ９＞化学処理：Ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ Ｂ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＤＭＳＯに１ｍｇ／ｍｌまで溶解し、−２ ０℃で保存した。ＣＫ６ ６ ６（ＳＩＧＭＡ）をＤＭＳＯに５ ０ｍ Ｍまで溶解し、４℃で保存した。実験：Ｈｕｖｅｃ（Ｌｏｎｚａ、Ｃ−２ ５ １ ９Ａ）をＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養し、継代４まで使用した。 ８×１ ０ ４細胞／ｃｍ２でＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に播種し、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３ ０ ０ ０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２μ ｇのプラスミドで形質移入した。 トランスフェクションの二時間後，Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地を抗生物質を含まないＥＧＭ培地に変更した。 SiRNAトランスフェクションのために、HUVECs(7.Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ１試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、２ ０ｎＭ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。 全ＲＮＡ抽出または固定の前に、細胞をさらに２ ４時間増殖させた。 オンTARGETplusヒトMARCKSL1siRNA-SMARTpool（Dharmacon）は、MARCKSL1をノックダウンするために使用されました。 Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔｐｌｕｓ Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を対照ｓｉＲＮＡトランスフェクションとして使用した。 細胞を4％PFA/PBSで固定し、0.1％Triton X-100で透過処理し、核標識のために14μ M DAPI、Alexa568-phalloidin（1）で染色した。:Ｆ−アクチンの可視化のためのＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および抗Ｖ Ｅ−カドヘリン抗体（１：１ ０ ０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、続いて抗ウサギＡｌｅｘａ４ ８ ８二次抗体（１：１ ０ ０ ０、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＥＣ接合をマークする。＜５ ４ ７ ７＞＜８ ２ ９ ９＞剪断応力実験のために、ＨＰＡＥＣ（Ｌｏｎｚａ）を、ｅｇｍ−２培地（Ｌｏｎｚａ）中の１％ゼラチン被覆皿上で１ ０ ０ ０〜１ ５ ０ ０細胞／ｍｍ２で培養し、第９継代前に使用した。 セルは、平行平板型装置45、46を用いて、15dyn/cm2で0.5、1または6時間の静的または層流せん断応力に曝された。 フローチャンバの一方の側は、培養HPAECsが休息した1％ゼラチンコーティングされたガラス板から成り、他方の側はポリカーボネート板から成っていた。 それらの平らな表面は、テフロンガスケットで200μ m離れて保持されていた。 チャンバには流体の入口と出口が設けられており、入口はシリコーンチューブで上部リザーバに接続されていた。 出口は下の貯水池に開いていた。 流れはローラー/管ポンプによって運転された。 液体（EGM-2媒体）は上部の貯蔵所から流れの部屋を通ってより低い貯蔵所に渡りました。 入口に設置された超音波通過時間流量計（Ht107、遷音速システム）で流量を監視し、上部リザーバと流れ室の出口との高さの差を変えることによって制御した。 EC層に作用するせん断応力（γ、dynes/cm2）の強度は、式γ=6μ q/a2bを使用して計算され、ここで、γは灌流液の粘度（ポイズ）、Qは流量（ml/s）、aおよびbは流路の断面寸法（cm）である。 剪断応力曝露後、ｑＰＣＲについて全ＲＮＡを単離した。＜5477＞＜8299＞定量的リアルタイムPCR：qPCRは、1x Luna Universal qPCR Master Mix（NEB）と400nMの順方向および逆方向プライマーを含む10μ L反応混合物中で、150ng（HPAECs）または500ng（HUVECs）の全RNAから生成されたcDNA1μ Lを用いて実施した。 反応は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７ ９ ０ ０ｈ ｔ装置上で四倍にして実行した。 データを、ＲＱ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析し、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用して、２−Δ Δ Ｃｔ法４ ７を使用して、ＭＡＲＣＫＳＬ１ｍＲＮＡ相対発現を計算した。
全マウントインサイチュハイブリダイゼーション: Whole mount in situハイブリダイゼーションは、標準protocol48に従って行われました。 胚は4％PFAで24、48および72hpfに固定し、10μ g/mLのプロテイナーゼKで透過処理したハイブリダイゼーションは、5％デキストラン硫酸ナトリウム（MW=500kDa）を含む緩衝液中で70℃で一晩行った。 ストリンジェンシー洗浄後、標本をマレイン酸緩衝液中の２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）で遮断し、アルカリホスファターゼ（ｒｏｃｈｅ、１：５ ０ ０ ０）と結合した抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）抗体と一晩インキュベートし、４℃で胚を染色緩衝液中のＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。 胚は一晩70％グリセロールでクリアし、Leica M205FA顕微鏡を使用して撮像した。 Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ ＳＰ６またはＴ７キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全長ｃＤＮＡをコードするプラスミドから、ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ ｓｐ６またはＴ７キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ ｓｐ６およびｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ ｓｐ６またはＴ７キッ
単細胞RNA配列決定：ECsは、Tg（kdrl：EGFP）s843トランスジェニック胚から単離されました。 細胞選別は、Ｆａｃｓａｒｉａｉｉ細胞選別機（Ｂ Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。 単細胞懸濁液を１ ０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステムに装填し、ｃＤＮＡライブラリーを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ３’ＧＥＭ，Ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ ｖ２（１ ０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用して構築した。 ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈ Ｉｓｅｑ１ ５ ０ ０シーケンサ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＵＳＡ）で配列決定した。 Cell Ranger v2.1は、Illumina sequencersによって生成されたraw base call（BCL）ファイルをFASTQファイルに多重化し、整列、バーコードカウント、およびUMIカウントを実行するために使用され 配列決定読み取りは、ゼブラフィッシュゲノムアセンブリ（Grcz11、Ensemblリリース92）にマッピングされました。 さらなる分析は、Ｓｅｕｒａｔ ｐａｃｋａｇｅ４ ９ｉｎ Ｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（＜３ ０ ２ ３＞）を用いて行った。 発現マトリックスは、最初に、下流分析のために最小３個の細胞および最小２ ０ ０個の遺伝子を発現した細胞で発現される遺伝子を保持することによ 細胞を、低ミトコンドリア含量を発現する細胞を選択することによってさらに濾過した（＜６ ５ ８ ５＞７％）。 次に、各細胞の遺伝子発現を全発現によって正規化するＮｏｒｍａｌｉｚｅｄｄａｔａ関数を使用してデータを正規化した。＜5477＞＜8299＞血管径の定量：ライブTg（fli1ep：Lifeact-EGFP）zf495;Tg（kdr-l:ras-mCherry)s916トランスジェニック野生型またはmarcksl1変異胚を50-52hpfで撮像した。 共焦点zスタックは、Olympus UPLSAPO40×/NA1.25シリコーンオイル浸漬目的で取得しました。 Ｄ ＡおよびＰＣＶ直径の計算のために、卵黄延長に沿ったＩｓｖ間で４〜５の測定を行った（Ｉｓｖ番号１ ０〜１ ４）。 ＩＳＶ直径については、Ｄ ＡとＤＬＡＶとの間の各ＩＳＶ（Ｉｓｖ番号１ ０〜１ ４）に沿って平均６回の測定を行った。 測定はＦｉｊｉ（ＮＩＨ）を用いて行った。
EC数と増殖の定量化: ＥＣ数をカウントするために、５ ２種のｈｐｆ野生型、ｍａｒｃｋｓｌ１ａｒｋ２ ３、ｍａｒｃｋｓｌ１ｂｒｋ２ ４またはｍａｒｃｋｓｌ１ａｒｋ２ ３；Ｔｇ（ｋｄｒ−ｌ：ｒａｓ−ＭＣＨＥＲＲＹ）ｓ９ １ ６背景中のｍａｒｃｋｓｌ１ｂｒｋ２ ４胚を４％ＰＦＡ中に固定し、３μ Ｍ ＤＡＰＩで染色した。 共焦点zスタックは、Olympus UPLSAPO40x/NA1.25シリコーンオイル浸漬目的で取得しました。 Ｄ ＡとＤＬＡＶとの間の各ＩＳＶ（Ｉｓｖ番号９〜２ ２）で核を計数した。 Ｉｓｖ、野生型またはｍａｒｃｋｓｌ１ａｒｋ２ ３；ｔｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＥＧＦＰ）ｚｆ４ ９ ５；Ｔｇ（ｋｄｒ−ｌ）中のｍａｒｃｋｓｌ１ｂｒｋ２ ４胚における有糸分裂Ｅｃを定量するために、ｔｇ（Ｆｌｉ１ｅｐ：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＥＧＦＰ）中の有糸分裂ｅｃを定量する。:ｒａｓ−ＭＣｈｅｒｒｙ）ｓ９ １ ６背景を４％ＰＦＡ中で３ ０、３ ６および４ ８ｈｐｆで固定し、１％ＤＭＳＯ／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０中で透過処理し、抗ホスホＨ３抗体（１：２ ５ ０、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、続いて抗ウサギＡｌｅｘａ４ ８ ８二次抗体（１：１ ０ ０ ０、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および３μ Ｍ ＤＡＰＩ 共焦点zスタックは、Olympus UPLSAPO40x/NA1.25シリコーンオイル浸漬目的で取得しました。 有糸分裂細胞（ＰＨ３陽性細胞）を、胚の両側のＩｓｖ中で計数した（Ｉｓｖ番号９−２ ２）。 ＭＣｈｅｒｒｙ蛍光を用いてＩＳＶを可視化した。 ISVあたりの唯一のph3陽性細胞は、ISV位置に関係なく検出されました。 カウント中に、我々は、単一の細胞として終期のECを検討しました。 ＥＣ分割の数をカウントするために、野生型またはｍａｒｃｋｓｌ１ａｒｋ２ ３；ｔｇ中のｍａｒｃｋｓｌ１ｂｒｋ２ ４胚（ｆｌｉ１ｅｐ：Ｌｉｆｅａｃｔ−ＥＧＦＰ）ｚｆ４ ９ ５；Ｔｇ（ｋｄｒ−ｌ：ｒａｓ−ＭＣＨＥＲＲＹ）ｓ９ １ ６背景を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＰＬＳＡＰＯ３ ０×／ＮＡ１． 各ＩＳＶ（Ｉｓｖ番号１ １−１ ５）における細胞分裂の数を定量した。
先端皮質におけるアクトミオシンレベルの定量化：ライブTg（fli1：Lifeact-mCherry）ncv7; Ｔｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：ＥＧＦＰ−Ｐｌｃ Δ１Ｐｈ）ｒｋ２ ６およびＴｇ（ｆｌｉ１ｅｐ：ｍｙｌ９ｂ−ＥＧＦＰ）ｒｋ２ ５；Ｔｇ（ｋｄｒ−ｌ：ｒａｓ−ＭＣｈｅｒｒｙ）ｓ９ １ ６ゼブラフィッシュ胚を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＵＰＬＳＡＰＯ６ ０×／ＮＡ１． 頂端皮質に沿った細胞質におけるLifeactまたはMyl9Bの強度をフィジーを用いて測定した。 平均皮質強度と細胞質強度の比を計算した。
in vivo細胞形状解析：isvにおけるECsの単一細胞標識は、野生型、marcksl1brk24またはmarcksl1ark23におけるfli1ep：lynEGFPプラスミドのモザイク発現によって達成された。marcksl1brk24変異胚またはfli1ep:野生型胚におけるmarcksl1b-EGFPプラスミド。 2dpfでは、微小血管造影を行ったし、血管はオリンパスUPLSAPO60×/NA1.2水浸対物レンズ0.25μ mの光学Z面間隔でイメージングしました。 IsvのECsのセル形状解析は、Pythonで開発されたカスタム書かれたImageJスクリプトを使用して半自動化された方法で実行され、refに記載されている方法を拡張 50. 画像は、下流のメモリ要件を減らすために最初に粗雑にトリミングされ、追加のメタデータ（血管の種類と胚の識別子）が移入されました。 その後、別のスクリプトを実行して、容器の周りのセルを2Dサーフェスに投影し、ラップ解除しました。 簡単に説明すると、トリミングされた画像は、血管の種類に基づいて最初に回転され、画像スタック内の血管軸をZ方向に粗く整列させ、蛍光モザイクセルラベルのチャネルを投影用に選択した。 血管軸は、手動で画像スタックを介して約10μ mごとに血管の位置を定義し、Catmull-Romスプラインフィットと補間を実行することによって識別されました。 次いで、３次元で血管軸をまっすぐにするために、データを変換した。 次に、投影チャネル内の最大強度の位置は、血管軸の周りの1°間隔で光線に沿って同定された。 この情報を用いて、軸が血管軸に沿った位置および角度位置である平面に蛍光強度を投影し、投影された平面上の各位置における血管軸からの距離をマップするために使用した。 このセルは，Ｉｍａｇｅｊの組み込みインターモード法を用いて投影画像から同定した。 次に、セルに関連付けられた各ピクセルの辺で表される円弧の長さを計算しました（\(l=\frac{{2\pi rd^2}}{{360}}\), ここで、ｒは細胞関連画素と血管軸との間の距離であり、ｄは画素の側面である）であり、細胞表面積およびアスペクト比の測定値を生成するために使＜5477＞＜8299＞In vitro細胞形状分析：固定HUVECsをOlympus UPLSAPO40×/NA1.25シリコーン油浸漬目的物で撮像した。 すべてでは、各カバースリップから10-20の画像を定量化のために撮影し、カスタム書かれたImageJスクリプトを使用して半自動化された方法で分析しました。 マルチチャンネルzスタックを最大限に投影し、GFPマーカーを示すチャンネルを機器のメタデータから識別しました。 ImageJの組み込みの大津しきい値法を使用して、関心のあるセルを背景から分離し、105μ m2より小さい領域と視野の境界に接触する領域を除去することに その後の手動介入ステップにより、ユーザーは、誤ってマージされたセルを分離したり、しきい値操作によって見逃されたセルを含めるために、このバイ 次に、スクリプトは、各セルROIの面積と周囲を計算しました。 さらに，対応する凸包の周囲に対するセル周囲の比に基づいて各セルについて”spikiness指数”を計算し，セルのアスペクト比の値をセルROIＩにフィットした楕円の長軸と短軸の比として計算した。
膜blebbingの分析:膜blebbingに関するプロットは、カスタム書かれたImageJスクリプトを使用して半自動化された方法で生成されました。 各撮像された膜について、膜エッジの輪郭長とエッジ端点間のユークリッド距離との比を各時点で計算した。 得られた時系列から、パワースペクトル密度はウェルチの方法51によって計算された。 パワースペクトル密度は、blebsが形成された特性時間（0.04–0.06Hz）として経験的に定義された関心のあるウィンドウにわたって平均化され、これらの平均値は、実験（Marksl1B過剰発現）と制御条件との間で比較された。
blebsにおけるアクチンおよびミオシンII動態の解析: Blebbing細胞におけるアクチンまたはミオシンの動態に関連するプロットは、カスタム書かれたImageJスクリプトを使用して半自動化された方法で生成され マルチチャネルタイムラプスzスタックは、最初にz次元に沿って最大に投影されました。 ソフトウェアは、膜ラベリングの代理としてMarksl1B-EGFPチャネル上で実行されているImageJの組み込みのOtsuしきい値法を使用して、すべての時点で二つのユーザー定義のアンカーポイント間のblebのエッジを自動的に識別しました。 Ｂｌｅｂエッジの正確な同定を確実にするためのユーザ品質管理ステップに続いて，エッジに沿ったアクチン／ミオシンチャネル強度プロファイルを各時点で抽出し，ｋｙｍｏｇｒａｐｈで時間に対してプロットした。 各時点で強度統計をｂｌｅｂ領域と共に抽出し，ここではエッジで囲まれたｚ投影領域とｂｌｅｂ先端から最も遠いｂｌｅｂの両側の点をユーザ定義のアンカーポイントを結ぶ線に垂直な軸に沿って結ぶ線として定義し，平均アクチン／ミオシンチャネル強度とｂｌｅｂ領域を時間に対してプロットした。
皮質アクチン密度と束幅の定量化: HUVECsにおけるアクチンの高解像度画像は、AiryscanおよびGaAsP検出器を備えたZeiss LSM880共焦点顕微鏡に搭載されたPlan-APOCHROMAT63x油対物レンズを使用して取得しました。 各観察内の約3μ mの平方領域をランダムに選択し、それらの領域のうち、皮質メッシュワークをカバーする典型的には8つの光学セクションをトリミング トリミングされたスタックのZ軸に沿った投影画像は、最大強度投影によって生成され、以下の手順に供された。 画像内のアクチンフィラメントはあいまいであり，ネットワーク全体を評価することは不可能であったので，限られた領域内のアクチンフィラメントの数をアクチンメッシュワークの密度として定量化した。 これは、Ｘ軸およびＹ軸に沿った走査線を４画素毎に設定することによって行われ、各走査線に沿った画素値をＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタ５ ２に供して、１次導関数を アクチンフィラメントは、走査線の強度ピークであるゼロ交差点を見つけることによって同定された。 ピークの数を走査線の画素数（画像の幅または高さ）で除算し、これらの値の平均を取ることによって画像上のフィラメントの密度を計算した。
アクチン束の幅を定量化するために、Savitzky-Golayフィルターによって計算された一次導関数のゼロ交差点を見つけ、Hilditch thinningアルゴリズムを適用することによっ アクチンフィラメントの分岐点または交差点が測定に影響を与える可能性を排除するために、骨格化されたライン内にある分岐点を排除し、分 全体のセグメントに対する直交軸は、固有ベクトルを得ることによって決定され、蛍光強度は、Lanczos-5補間法でセグメントの重力中心を走る直交軸に沿っ 次に，フィラメントの直径を，セグメント全体に対して直交軸に沿ってサンプリングされた線内のピーク強度の半分以上を示す領域の幅によって決定した。＜５ ４ ７ ７＞＜８ ２ ９ ９＞統計：Ｐｒｉｓｍ８（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．). サンプルサイズは事前に決定されておらず、実験は無作為化されず、研究者は実験および結果評価中の割り当てに盲目にされなかった。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryを参照してください。
