phaseolus vulgaris種子からのアスパラギナーゼの精製と特性評価

要約

細菌からのL-アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病の治療に使用されている。 本研究の目的は、微生物源の代わりにphaseolus vulgaris種子からL-アスパラギナーゼを精製し、特徴付けることであった。 Ｌ-アスパラギナーゼを見かけの均一性に精製した。 この酵素の分子量は79kDaである。 精製アスパラギナーゼは多くのアスパラギンおよびグルタミン類似体に対して非常に低い活性を示した。 Ｌ-アスパラギナーゼはグルタミナーゼ活性を有さなかった。 精製酵素の速度論的パラメータ、KmおよびVmaxは、それぞれ6.72mMおよび0.16μ mであることが判明した。 この酵素は8.0で最適pHを有していた。 酵素は、アルカリpH（pH7.5–9.0）で高い安定性を示した24hまでインキュベートしたとき。L-アスパラギナーゼは、同じ温度最適と37℃での熱安定性を有していた。K+は、試験された他の金属と比較して150％アスパラギナーゼの活性を大幅に強化することができた。 Ｌ-アスパラギナーゼはグルタミナーゼ活性を示さず，広範囲の生理学的条件にわたって良好な安定性を示し，急性リンパ芽球性白血病の治療の候補として使用できると結論した。

1. はじめに

l-asparaginase(L-asparagine amidohydrolase E.C.3.5.1.1)は、急性リンパ芽球性白血病および非ホジキンリンパ腫の治療に使用されます。 抗癌治療におけるL-アスパラギナーゼの使用は、リンパ芽球の成長に不可欠なアミノ酸であるL-アスパラギンを、血清および脳脊髄液中のアンモニアおよびL-アスパラギン酸に切断する能力に基づいている。 癌細胞のほとんどは存続のためのこのアミノ酸の外因性の源に依存しています。 しかし、正常細胞はL-アスパラギンを合成することができ、したがってこの酵素による処理による急速な枯渇の影響を受けにくい。 またlアスパラギナーゼがポテトチップの揚げられ、オーブン調理された食糧のアクリルアミドの形成を特に減らすのに使用することができます。 アクリルアミドの生成は遊離アスパラギンと還元糖の反応に起因した。 アスパラギナーゼによるアスパラギンの枯渇はアクリルアミド形成を防止した。

L-アスパラギナーゼは、植物、動物、微生物に広く分布しています。 植物では、この酵素はLupinus albusの発育中の種子で最初に検出された。 アスパラギナーゼはＬ．ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｕｓの成熟種子のｔｅｓｔａからも精製されている。 この酵素の2つの形態が同定されている。 K+非依存型はL.arboreusとL.polyphyllusに見られ、K+依存型はPisum sativumと他のルピナス種を含むいくつかの他のマメ科植物種に見られる。 Ｌ．ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｕｓ由来のＫ＋非依存型に対する抗体を用いた研究では，エンドウ豆のアスパラギナーゼまたはＫ＋依存性酵素を含むルピナスの品種のいずれかとの交差反応は認められず，アスパラギナーゼの二つの形態が免疫学的に異なることを示唆した。

急性リンパ芽球性白血病の治療における植物アスパラギナーゼの使用に関する情報はほとんど報告されていない。 したがって，本研究の主な目的は，抗癌剤として使用され，その免疫学的応答による副作用を引き起こす微生物源からのＬ-アスパラギナーゼの代わりにＬ-グルタミナーゼを含まないｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ種子からＬ-アスパラギナーゼを精製し，特徴付けることであった。

2. 材料および方法

2.1. 植物材料

Phaseolus vulgaris cvから成熟した種子。 Giza6は、エジプトのカイロの農業研究センターから入手した。

2.2. アスパラギナーゼ

の精製2.2.1. 粗抽出物

アスパラギナーゼの粗抽出物は、phaseolus vulgaris cvから50gの種子の均質化によって調製した。 ギザ6 20mMトリスHCl緩衝液中、pH8.0 10%グリセロール、50mM KCl、12.5mM β-メルカプトエタノール、および1mM PMSFを含有する。 ホモジネートを１ ０，０ ０ ０×ｇで遠心分離し、上清を粗抽出物と命名した。 粗抽出物を固体ショ糖に対して透析により濃縮した。

2.2.2. ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム＜３ ９ ３ ４＞＜７ ８ ９＞濃縮粗抽出物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１ ５×１． 酵素を、同じ緩衝液中に調製した異なる濃度のＫｃｌによって６ ０ｍＬ／ｈの流速で溶出し、３ｍＬの画分を回収した。 蛋白質の三つのピークをアスパラギナーゼ活性で溶出順序（アスパラギナーゼｉ，ＩＩ，ＩＩＩ）に従って溶出した。

2.2.3. セファクリルS-200

アスパラギナーゼI最高の活性を持つセファクリルS-200カラム（90×0。これを以前に同じ緩衝液で30mL/hの流速で平衡化し、3mLの画分を回収した。

2.3. アスパラギナーゼアッセイ

L-アスパラギナーゼの活性は、Wristonの修正法によって測定された。 L-アスパラギナーゼはL-アスパラギンをL-アスパラギン酸とアンモニアに触媒し、後者はネスラー試薬と反応してオレンジ色の生成物を生成する。 酵素アッセイ混合物は、900μ lの新たに調製したL-アスパラギン（20m m）50m M Tris-HCl緩衝液（pH8.0）、50m m KCl、および100μ lの酵素の粗抽出物から成っていた。 反応混合物を37℃で30分間インキュベートし、100μ lの15％トリクロロ酢酸を添加することによって反応を停止した。 反応混合物を１ ０，０ ０ ０×ｇで４℃で５分間遠心分離し、沈殿物を除去した。 上清中に放出されたアンモニアは、100μ lの上清および800μ lの蒸留水を含む試料に100μ lのNessler試薬を添加することによって比色技術を用いて決定された。 試料中の内容物をボルテックスし、室温で10分間インキュベートし、ODを425nmで測定した。 反応中に生成したアンモニアは硫酸アンモニウムで得られた標準曲線に基づいて決定した。 Ｌ−アスパラギナーゼ活性の１単位は、３ ７℃で１分間に１μ ｍｏｌのアンモニアを遊離する酵素の量として定義される。＜９ ９ ６＞＜５ ５ ６ ４＞２． タンパク質定量

タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準としてBradfordの方法によって定量した。

2.5. 分子量決定

天然の分子量は、セファクリルS-200によって決定された。 カラムは、シトクロムC（12,400）、炭酸脱水酵素（29,000）、ウシ血清アルブミン（67,000）、アルコールデヒドロゲナーゼ（150,000）、およびβ-アミラーゼ（200,000）で較正された。 デキストラン青（2,000,000）は、ボイド体積（Vo）を決定するために使用されました。 ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサブユニット分子量を推定した。 SDS変性ホスホリラーゼb(94,000)、ウシ血清アルブミン(67,000)、オボアルブミン(43,000)、炭酸脱水酵素(30,000)、大豆トリプシン阻害剤(20,000)、およびα-ラクトアルブミン(14,200)検量線

2.6. アスパラギナーゼの特性評価

2.6.1. 基質特異性

アスパラギナーゼ活性は、L-アスパラギンのいくつかの類似体を用いて決定された。 相対活性は，Ｌ-アスパラギンの異なる構造類似体に対して測定した酵素活性とＬ-アスパラギンによる酵素活性との割合として表された。

2.6.2. 速度論的パラメータ

ミカエリス定数（Km）と最大速度（Vmax）の値は、2-20mMの範囲の基質としてL-アスパラギンを用いて決定された。

2.6.3. PHの効果

アスパラギナーゼ活性のための最適なpHは、異なるpH値で活性をアッセイすることによって決定されました。 PH安定性は、基質の非存在下で5.0–9.0 24時間4℃のphで酵素のインキュベーションによって試験され、残留活性は、標準アッセイ条件下で決定された。

2.6.4. 温度の影響

アスパラギナーゼ活性の最適温度は、異なる温度で酵素をアッセイすることによって決定された。 加熱処理後、酵素溶液を冷却し、基質を添加した後に残留活性をアッセイした。

2.6.5. 金属イオン効果

酵素活性に及ぼす様々な金属イオンの効果は、基質を添加する前に10mMの金属イオンで酵素単独で15分間preincubatingすることによって決定された。 金属イオンの非存在下でアッセイした活性を100％とした。

3. 結果と考察

p.vulgaris由来のアスパラギナーゼの精製工程の結果を表1にまとめた。 DEAE-セファロースカラム（図1）上のクロマトグラフィーの溶出プロファイルは、アスパラギナーゼ活性を有するタンパク質の三つのピークを示した。 アスパラギナーゼ活性が最も高いピークをセファクリルS-200カラムに適用しました(図2)。 L-アスパラギナーゼIは21.7倍の比活性846単位/mgタンパク質で精製された。 アスパラギナーゼIは、SDS-PAGEによって評価されたセファクリルS-200カラムの後に純粋であることが証明された（図3）。 セファクリルS-200およびSDS-PAGE手順によるアスパラギナーゼIの分子量は、モノマーサブユニットとして79kDaの値をもたらした。 この知見は、Vigna unguiculata（70kDa）とLupinus polyphyllus（75kDa）からのアスパラギナーゼの分子量と一致しています。 58kDaの媒体の分子量はエンドウ豆の葉からのアスパラギナーゼのために検出されました。 細菌のアスパラギナーゼの分子量は140から160kDaの四量体サブユニットの範囲であった。 11.2kDaの非常に低分子量はStreptobacillus spのために検出されました。 Kk2S4アスパラギナーゼ

フィギュア1

DEAE-セファロースカラム（15×1.6cm i.d.）上のp.vulgarisからのアスパラギナーゼのクロマトグラフィーのための典型的な溶出プロファイル。 ２ ０ｍ ＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ緩衝液、ｐＨ８．

フィギュア2

セファクリルS-200カラム（90×1.6cm i.d.）上のDEAE-セファロース画分からのアスパラギナーゼIのゲルろ過。 カラムを20mMのTris-HCl緩衝液、pH8.0で30mL/hおよび3mLの画分の流量で平衡化した。

フィギュア3

phaseolus vulgarisからのアスパラギナーゼIの均質性および分子量の決定のためのSDS-PAGE。 (1)タンパク質マーカー;(2)セファクリルS-200アスパラギナーゼI.

アスパラギナーゼIの基質特異性は、多くのアスパラギンおよびグルタミン類似体を用いて調べられている（表2）。 L-アスパラギンによる活性は100％活性とみなされた。 DL-アスパラギンは酵素活性の30％を示し、DL-アスパラギンは1で構成されている : 1ラセミ混合物。 Ｄ-アスパラギン，Ｌ-アスパラギン酸，Ｌ-グルタミン酸類似体はアスパラギナーゼＩに対して非常に低い活性を示した。 したがって，ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のアスパラギナーゼｉはグルタミナーゼを含まない。 アスパラギナーゼのグルタミナーゼ活性による汚染は、抗癌療法の過程で副作用を引き起こした。 Ｌ．ａｒｂｏｒｅｕｓアスパラギナーゼはｌ-アスパラギンとｄ ｌ-アスパルチルヒドロキシマートのみを加水分解した。 Ｖ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａアスパラギナーゼはＬ-アスパラギンに特異的であり，Ｄ-アスパラギンを加水分解せず，Ｌ-グルタミンに特異的ではなかった。

精製された酵素の速度論的パラメータ、KmおよびVmaxは、それぞれ6.72mMアスパラギンおよび0.16μ mアンモニア/mLであることが判明した（図4）。 6.6と7.0mMの同様のKm値は、それぞれL.arboreusとL.angustifoliusからアスパラギナーゼのために決定されました。 ルピナス種子からのアスパラギナーゼは、アスパラギン（12.2mM）のための高いKmを持っています。 Km（1.2mM)V.unguiculataからアスパラギナーゼを決定しました。 細菌のために、大腸菌およびErwinia carotovoraからのL-アスパラギナーゼのKm値は、それぞれ3.5および7.14mMであった。

フィギュア4

ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ速度からのアスパラギナーゼｉのｌ-アスパラギン濃度への関連を示すＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ-Ｂｕｒｋプロット。

アスパラギナーゼIは8.0でpH最適を示した（図5）。 PH6.0と9.0の間で、その活性の50％以上が保持された。 生理的pHでの最大活性は、抗腫瘍活性のためのL-アスパラギナーゼの前提条件の一つであるが、酵素活性の80％がpH7.5で保持されていたので、精製された酵素 この酵素は、アルカリpH（pH7.5〜9.0）で安定性を示し、24時間までインキュベートしたときに元の活性の90％を保持しました（図6）。 しかし、いくつかの植物からのL-アスパラギナーゼのpH最適は8.0から8.5の範囲であった。 細菌からのL-アスパラギナーゼのほとんどは、アルカリ性pH最適（8.0–10）を示した。

フィギュア5

p.vulgarisからのアスパラギナーゼIのpH最適。 酵素活性は、前述のように標準的なアッセイ法を使用して種々のｐＨで測定した。

フィギュア6

p.vulgarisからのアスパラギナーゼIのpH安定性は、24時間4℃でインキュベーション後の異なるpHである。

アスパラギナーゼIは37℃で最適な温度を有することが判明した（図7）。 V.unguiculata（40℃）からのアスパラギナーゼの同様の温度最適が報告された。 この温度は緑膿菌およびＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍで報告された温度と同様であった。 Streptobacillus spの最適活性。 アスパラギナーゼは35℃で記録された。 逆に、Chrombacteriaceaeおよびproteus vulgarisからのL-アスパラギナーゼは、それぞれ20℃および57℃で観察された。 アスパラギナーゼIと温度安定性との間の非線形関係が検出されました(図8)。 酵素活性は37℃まで安定であった1hのインキュベーション後.Vからアスパラギナーゼ. unguiculataは40℃まで15分間インキュベーション後に安定していた。 P.carotovorumおよびC.annuumからのアスパラギナーゼは、それぞれ40℃および45℃で60分間インキュベーションした後、その初期活性を保持した。

フィギュア7

p.vulgarisからのアスパラギナーゼIの最適温度。 酵素活性は、前述のように標準的なアッセイ法を用いて種々の温度で測定した。

フィギュア8

ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のアスパラギナーゼｉの熱安定性。 基質を添加する前に、反応混合物を種々の温度で６ ０分間予備インキュベートし、続いて氷浴中で冷却した。 酵素活性は、前述のように標準的なアッセイ法を用いて測定した。 ゼロ時間での活性を１ ０ ０％活性とした。

アスパラギナーゼIに対する異なる金属イオンの効果を調べた（表3）。 金属イオンは10mMの濃度で使用された。K+はアスパラギナーゼIの活性を150％大幅に高めることができた。 植物では、K+非依存性およびK+依存性アスパラギナーゼが同定されていた。 Ｋ＋はＰ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅのエンハンサーとしても作用した。 しかし、V.unguiculataアスパラギナーゼはNi2+とCo2+によって活性化され、Mn2+、Zn2+、Ba2+、およびhg2+によって阻害された。 金属キレート剤としてのＥＤＴＡはアスパラギナーゼＩに対して部分的に阻害効果を示したが，ＥｄｔａはＰ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍアスパラギナーゼには影響しなかった。

4. 結論

p.vulgaris由来のL-アスパラギナーゼIは、抗癌療法の過程で副作用の可能性を減らすことができるグルタミナーゼフリー形態で精製された。 この酵素はｐ ｈおよび温度として広い範囲の生理学的条件にわたって良好な安定性を示した。 我々のプロジェクトの次のステップでは、p.vulgarisのL-アスパラギナーゼIは、急性リンパ芽球性白血病の治療のための潜在的な候補として使用されます。

利益相反

著者らは、この論文に関連する利益相反を開示することはありません。

謝辞

このプロジェクトは、サウジアラビア、キング-アブドゥルアズィーズ科学技術都市、科学技術革新のための国家計画（MAARIFAH）によって資金提供されました。 (11-1516-03) 著者はまた、技術サポートのための感謝の科学技術ユニット、キングアブドゥルアズィーズ大学で認めています。