キナーゼアッセイ
Swathi Arur
プロテインキナーゼ（1–10mg/mlの純粋なキナーゼのストック溶液）-これらのアッセイには、精製されたERK2キナーゼ（NEB）を使用します。 各酵素について、活性のための最適な緩衝液、イオン強度、およびpHを決定することが重要である。 これらの条件が確立されていない場合は、以下のプロトコルを出発点として使用することができます。
基質（10mMのストック溶液）–基質は通常、リン酸化部位モチーフにセリン/スレオニンを含む。 対照として、ＮＥＢによってＥＲＫ２キナーゼを較正するために使用されたミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａから得られた）を使用する。
さらに、基質は、アッセイに使用されるホスホセルロースフィルターへの結合を容易にするために正味の正電荷を有するべきである。 ホスホセルロース紙への定量的結合のためには、少なくとも2つの塩基性残基および遊離アミノ末端を有することが推奨される。 リン酸化部位モチーフが知られていない場合は、一般的なチロシンキナーゼ基質を使用することができる。 例えば、「ミエリン塩基性タンパク質」（多くのＭａｐｋのための非特異的基質である）。 初期反応には、0.7-1.5mMの基質濃度を使用する必要があります。 合成ペプチドのリン酸化の速度論的パラメータを決定するには、ペプチド濃度の範囲が必要です
10Xキナーゼ緩衝液–5mg/mL BSA（アッセイ管へのキナーゼ吸着を防ぐため）、150mM Tris-Cl（pH7.5）が含まれています。
ATP/Mgcl2(Upstate Biotech-Magnesium/ATP Cocktail#20–113から購入)-1-5mMのストック溶液が便利です。 ほとんどのＭａｐｋは、１ ０〜１ ５ ０μ ｍの範囲のＡＴＰのＫｍ値を有するので、速度論的実験のために、ペプチドのＫｍおよびＶｍａｘの値に到達するためにＡＴＰの飽和濃度を使用す
ATP–10mCi/mL。
ERK2キナーゼアッセイ
a)オートラジオグラフィーアッセイ:
- 標準キナーゼアッセイは、25μ lの容積で実施される：＜6051＞＜3227＞2.5μ lの10Xキナーゼバッファー＜6051＞＜3227＞5μ lの1.0mM Mgcl2/ATP（0.2mM最終濃度）＜6051＞＜3227＞ATP（100-500cpm/pmol）＜6051＞＜3227＞3μ lの10mm基質（1.2mMの最終濃度)
- 1UのERK2キナーゼ
- H2Oを25ulにする。
1. 実験の前に、アッセイを完了するのに十分な緩衝液、ATP、およびATPを含むカクテルを調製する。 異なった基質の集中の試金のために、基質は薄くなり、各管に別に加えられるべきです。 カクテルを1.5mlのマイクロ遠心管に分配した後、管を30℃の水浴中に30分間置きます。 反応はキナーゼの添加によって開始され、30℃で進行させるべきである。
2。 所望の時間の後、2X SDS試料緩衝液を添加することによって反応を終了させ、ゲル上で実行する。
3. Whatman3.0のペーパーのゲルを乾燥し、乾燥したゲルをautoradiogramに露出し、カセットを-70cfor2hrsで保って下さい。 （より長い露出のためにフィルムがそれに新しいautoradiogramを置く前に再度乾燥していることを確かめて下さい）。
b)速度論的分析:
1. 上記のようにキナーゼアッセイを行い、今回は50nmから1mmまでの基質の異なる濃度を使用します。 各反応に４ ５μ ｌの氷冷１ ０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加することにより、３ ０分後に反応を停止させる。 反応を渦にする。
3. マイクロ遠心(10K rpm)で2分間回転します。
4. 上清の35ulを直径2.1cmのWhatman P81セルロースリン酸フィルター円にスポットします。
6. P81フィルター円を500mlの冷たい0.5%リン酸と三回洗浄して下さい（洗浄ごとの5-10分）。 洗浄のステップの進歩は空白の反作用のためのP81フィルター円を取除き、ガイガーカウンターと点検することによって続くことができる。
7. 室温で200mlのアセトンで一度5分間洗浄する。
8. フィルター円が室温で乾燥するようにして下さい。
9. フィルター円をシンチレーションバイアルに入れ、シンチレーションカウンターで乾燥したパッドを数えて32Pの取り込みを測定します。 キナーゼ反応（例えば、ｃｐｍ／ｐｍｏｌ中）におけるＡＴＰの比活性は、反応の小さな試料（２〜５μ Ｌ）をＰ８ １フィルター円上にスポッティングし、直接計数すること（洗浄なし）によ キナーゼ反応（マイナスブランク）で得られた分あたりのカウントは、反応中に転送されたリン酸塩のモルを決定するために比活性で除算されます。
基質リン酸化の速度論
MAPKによる基質のリン酸化の速度論的パラメータは、上記のプロトコルのバリエーションを使用して決定することができます。
1. タンパク質が基質であることを確立するために、高濃度の基質で反応を行う。
2. 試金の酵素の集中を変えて下さい。 基質のリン酸化の速度は試金の条件の下で酵素の集中に比例しているべきです。 この実験は、速度論的研究に必要な酵素の量を決定するためにも使用される。
速度を決定するには、基質のリン酸化の時間経過を行う必要があります。 この場合、より大きな酵素反応を調製する（我々は150ulを使用する）。 所望の時点で、２ ５ｕｌのアリコートを取り出し、４ ５ｕｌの氷冷１ ０％ＴＣＡを含有する微小遠心管に移し、上記のように反応を分析する。 基質のリン酸化は時間とともに線形でなければならず、速度定数の測定のために反応の初期速度（5％）を使用すべきである。
3. アッセイ中の基質濃度を変化させる。 速度とペプチド濃度のプロットを使用して、Kmの値の初期推定値を取得します。 この初期測定では、広範囲の基質濃度（例えば、２ ０μ Ｍ〜２ｍ Ｍ）を使用すべきである。
4. Km（基質）およびVmaxを決定するには、基質濃度を変化させ、リン酸移動速度を測定する。 基質濃度の良い範囲は、Kmの倍数である：0.125x Km、0.25x Km、0.5x Km、1.0x Km、2.0x Km、4.0x Km、8.0x Km。 最良の結果を得るためには、反応を三重に行う必要があります。
5. 運動定数は、ＮＦＩＴ（Ｉｓｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，Ｔ Ｘ）のような反復プログラムを使用して双曲線速度対プロットに適合する重み付け非線形最小二乗法によって決定される。
RARの計算：
RAR：相対受容体比=Vmax/Kmタンパク質が基質として機能する能力の全体的な尺度として定義されます。
特定の基質のRARをミエリン塩基性タンパク質で正規化する、すなわち、各基質のRARの値を計算し、ミエリン塩基性タンパク質のRARの値で除算する（したがってMBPを1.0に設定する）。
