Knudson仮説は、two-hit仮説としても知られており、ほとんどの腫瘍抑制遺伝子は、表現型の変化を引き起こすために、突然変異またはエピジェネティックサイレンシングのいずれかを介して、両方の対立遺伝子を不活性化する必要があるという仮説である。 それは1971年にAlfred G.Knudsonによって最初に定式化され、癌関連遺伝子の同定に間接的につながった。 クヌードソンはこの研究で1998年のアルバート-ラスカー臨床医学研究賞を受賞した。
Knudsonは、遺伝性疾患としても散発的にも発生する網膜の腫瘍である網膜芽細胞腫の症例について統計的分析を行った。 彼は、遺伝性網膜芽細胞腫は散発性疾患よりも若い年齢で起こることに留意した。 さらに、遺伝性網膜芽細胞腫を有する小児は、しばしば両眼に腫瘍を発症し、根底にある素因を示唆している。
クヌードソンは、DNAへの二つの”ヒット”が癌を引き起こすために必要であることを示唆した。 遺伝性網膜芽細胞腫の小児では、後にRB1遺伝子として同定されるようになった最初の突然変異が遺伝し、2番目の突然変異が獲得された。 非遺伝性網膜芽細胞腫では、腫瘍が発症する前に2つの突然変異、すなわち「ヒット」が行われなければならず、後の発症を説明した。
後に発癌（癌の発生）は、原発癌遺伝子（細胞増殖を刺激する遺伝子）の変異と、増殖を抑制する遺伝子である腫瘍抑制遺伝子の不活性化の両方に依存することが判明した。 しかし、Knudsonの仮説は、腫瘍抑制遺伝子のヘテロ接合性に特異的に言及している。 単一の機能的腫瘍抑制遺伝子が通常は十分であるため、両方の対立遺伝子の不活性化が必要である。 いくつかの腫瘍抑制遺伝子は、（遺伝的またはエピジェネティック修飾のいずれかを介して）遺伝子の一つのコピーの阻害がハプロイン不全と呼ばれる悪性表現型を奨励することができるように、”用量依存性”であることが見出されている。
