유전학

소개

면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 신경세포 접착 분자로,신경계 발달에 핵심적인 기능을 가지고 있다(이토와 후시키,2015). 신경질적인 증후군과 연관되어 있는데,이는 신경질적인 증후군으로 요약되어 있습니다. 그들은 다음과 같이 분류됩니다: 2015 년 11 월 15 일(토),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년 12 월 15 일(일),2015 년

약 282 개의 질병을 일으키는 돌연변이가 보고된 바 있다.

2019.2(https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/all.php). 유전자 변형은 다양하다; 282 환자에서 돌연변이 데이터 분석 공개 51%미 센스와 말도 돌연변이,25%삭제,5%삽입,그리고 19%스플라이스 사이트 변경 하지만 병원 성 잠재력을 가진 1 캠에서 침묵 돌연변이 드문,그리고 침묵 돌연변이 특히 전체 엑솜 시퀀싱(웨스)탐지에서 종종 무시 했다.이 연구에서는,웨스를 사용하여,우리는 태아 수두증으로 5 개의 지속적인 임신을 보고한 중국 임신부의 태아 유전자를 검사했습니다;우리는 단지 새로운 침묵하는 돌연변이를 찾아냈습니다. 흥미롭게도,추가 분석을 통해 우리는 자동 돌연변이 생성 잠재적인 5’스플라이스 사이트 합의 시퀀스,엑손 5 에서 72 혈압의 프레임 삭제에서 발생할 것 이라고 표시 하 고 1 캠 단백질의 24 아미노산.

사례 발표

28 세의 건강한 여성이 다른 병원에서 태아 수두증으로 인한 4 건의 자발적인 임신 종료 후 우리 클리닉에 의뢰되었습니다. 모든 태아는 남성이었다. 우리 병원(중국 절강 성 절강 대학 의과 대학 여성 병원)에 도착했을 때,그녀는 이미 임신 24 주에 다섯 번째 임신 중이었고 이미지 검사를 통해 태아 수두증을 앓고있었습니다. 유전 적 원인을 탐구하기 위해 태아 혈액 샘플링은 재태 연령 26 주에 수행되었습니다. 태아 및 부모 샘플 모두에 대 한 기존의 세포 유전학 연구를 수행 하 고 태아 샘플 추가 단일 뉴클레오티드 다형성(뉴클레오티드)배열 및 웨스에 의해 분석 되었다.

이 연구는 절강 대학교 의과 대학 여성 병원 윤리위원회의 권고에 따라 수행되었으며 헬싱키 선언에 따라 본 연구의 모든 참가자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 이 연구 프로토콜은 중국 절강 대학 의과 대학 여성 병원 검토위원회의 승인을 받았습니다.

재료 및 방법

태아 제대혈 및 말초 제대혈의 핵형은 콜히친에 의해 중기기에 체포 된 적어도 30 개의 혈액 림프구의 통상적 인 핵형에 의해 결정되었다. 배양된 세포의 지 밴딩 핵형 약 10 메가바이트의 해상도로 320-400 밴드 수준에서 수행 되었다. 2015 년 11 월 15 일(토)부터 2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 15 일(일)까지,2015 년 12 월 본 연구에서는 염색체 분석 제품군(캘리포니아 산타클라라,어피메트릭스)에 의해 데이터를 분석하였다. 복사 번호 결과의 보고 임계값은 이익을 위해 50 의 마커 카운트를 가진 500 킬로바이트로,손실을 위해 50 의 마커 카운트를 가진 200 킬로바이트로 설정되었습니다.

전체 엑솜 시퀀싱

웨스의 주요 부분은 베이징 게놈 연구소에 의해 제공되었다. 200-250 혈압의 쌍 엔드 라이브러리를 생성하기 위해 코바리스 220(미국 매사추세츠 주)에 의해 단편화되었다. 모든 증폭되는 라이브러리에서 수행 BGISEQ-500 플랫폼,single-strand DNA 혼합 MGIEasy™DNA 라이브러리 준비 키트 V1(BGI,심천,중국)다음 서열을 사용하여 100SR 화학 BGISEQ-500RS 높은 처리 시퀀싱 키트(BGI,Shenzhen,China).2009 년 버로우즈-휠러 얼라이너 멀티비전 소프트웨어 패키지를 사용하여 인간 게놈 레퍼런스에 맞춰서 표적화된 시퀀싱 및 필터링에서 파생된 클린 판독값(90 혈압의 길이)을 측정하였다. 1999 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일,2009 년 12 월 15 일 2010 년 12 월 11 일에 확인함…………… 우리는 변이체의 효과를 예측하기 위해 콘델,선별,폴리펜 -2,경전철,돌연변이 감별사 및 필롭을 사용했습니다. 병원성 변이체는 미국 의학 유전학 및 유전체학 대학에서 발행 한 프로토콜에 따라 평가됩니다., 2015). 인간 유전자 돌연변이 데이터베이스는 돌연변이를 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 모든 잠재적 인 병원성 변이체는 생거 시퀀싱 방법을 사용하여 검증되었습니다.또한,제대혈 단핵세포와 제대혈 단핵세포는 피콜 밀도 구배 분리에 의해 분리되었다. 그 결과,그 결과는 다음과 같습니다. 추출 된 총 전기는 역전사되었습니다. 골드스타 베스트 마스터 믹스(베이징 씨위바이오) 프라이머 시퀀스가 나열됩니다:L1CAM-DNA-5F,CCCACCCGTCCTTTCCTA;L1CAM-DNA-5R,CGCTCGTCCTGCTTGATGT; L1CAM-mRNA-4-6-F GGTGTCCACTTCAAACCCAA;및 L1CAM-mRNA-4-6-R,GCGGCTTCCTGTCAATCA. 생거 시퀀싱은 분석기에 의해 수행되었다.

결과

28 세의 건강한 여성이 태아 수두증으로 인한 4 건의 자발적인 임신 종료 후 우리 클리닉에 의뢰되었습니다. 모든 태아는 남성이었다(그림 1 에이). 가족 혈통 보여 보였다. 그녀는 이미 임신 26 주에 다섯 번째 임신 중이었습니다. 태아 뇌실 비대는 태아 초음파 검사 및 자기 공명 영상에 의해 검출되었으며,이는 뇌수종의 존재를 지속적으로 입증했습니다. 그들은 양측 대뇌 뇌실과 제 3 뇌실이 분명히 확장되었고,뇌내 및 뇌량의 무기에 심한 뇌수종이 있음을 보여 주었다(그림 1 비).

가능한 유전 적 원인을 탐구하기 위해 우리는 핵형 분석 및 태아 혈액 샘플링을 분석하기 위해 핵형 배열을 수행했으며 긍정적 인 결과를 발견하지 못했습니다. 맥락막 혈관 신생 결과는 유전자 발현 옴니버스(지리적)에 침착되었다.

그런 다음 웨스에 의해 태아를 발견했습니다. 가능성이 병원 성 변형 식별을 찾는 분석 전략 그림 1 에 표시 되었습니다. 변종 목록(테이블 에스 1)변형 빈도,돌연변이 상태 및 상속 모드의 스크리닝을 통해 획득되었습니다. 뇌수종 관련 유전자(마력:0000238,http://compbio.charite.de/hpoweb/showterm?id=HP:0000238#id=HP_0000238)(표 에스 2)를 고려하여,의 침묵하는 돌연변이를 제외하고는 추가적인 주목할만한 돌연변이가 없었다. c.453GT 지 않았습보고서 HGMD 및 ClinVar 과에서 찾을 수 없습니다 dbSNP,gnomAD 및 기타 데이터 집합입니다. 의 표준 및 지침에 따라(리차드 등. 2015),아직”병원성”또는”병원성 가능성”의 기준에 도달하지 못했지만 다른 잠재적 인 돌연변이는 없었다;우리는 발견 된 침묵의 돌연변이에 대한 추가 분석을 할 수밖에 없었다.

전통적인 생각에 따르면,이 염기 치환은 코돈 151 의 세 번째 염기에서 발생했는데,이는 글리신을 암호화하여 중성 돌연변이(글리시 151=)를 생성한다. 이 변종은 생거 시퀀싱(그림 1 씨)에 의해 부부의 태아 제대혈 및 말초 혈액에서 추출한 유전자에서 확인되었습니다. 그 여자는 이형 접합 돌연변이를 가지고 있었고,그녀의 남편은 야생형 유전자형이었다.

으로 돌연변이 선별(http://www.mutationtaster.org/),c.453GT 으로 득점”질병을 일으키는 원인.”그것은 단백질 특징이 영향 받을지도 모르다 결합 위치가 변화될지도 모르다는 것을 보여주었습니다;우리는 이 침묵하는 돌연변이에 있는 엘 1 캠 기능의 잠재적인 접합 효력에 관하여 궁금했습니다. 침묵하는 돌연변이는 뒤에 오는 온라인 소프트웨어 제품을 사용하여 시험되었다:넷젠 2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)와 엔엔스플라이스(http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html);5’잠재적인 결합 위치는 또한 엘원캠씨에서 창조될 것으로 예측되었다.소프트웨어 제품을 사용한 돌연변이(그림 2). 결과는이 조용한 돌연변이가 정상적인 엑손 6/인트론 6 스플 라이스 사이트(그림 2 에이)에서 상류의 잠재적 인 5’스플 라이스 사이트 72 혈압을 생성했음을 보여주었습니다. 이 경우,우리는 길이 변화를 찾을 수 있습니다. 엑손 4-6 을 증폭 할 수 있도록 설계된 프라이머를 사용하여 수행되었습니다. 실제로 보여주는 짧은 밴드의 잘라내기에서 태아 cDNA PCR(II:5),동 밴드에서 증폭 L1CAM mRNA 포함된 예상되는 긴 밴드에서 남편 cDNA PCR(나:1)임신 한 여성의 긴/짧은 밴드(나는:2)(그림 2 비). 증폭 된 단편의 직접 시퀀싱은 삭제가 수컷 태아의 엑손 5 의 마지막 72 혈압과 관련이 있음을 보여 주었다(여자는 담체였다)(그림 2 기음). 우리는 중요한 병원성 증거를 얻었다.

토론

웨스에 의해 침묵하는 돌연변이가 종종 발견되었지만,주의가 불충분하여 선진 선전이 누락되었습니다. 이 연구에서 우리는 뇌수종을 가진 중국 가족의 유전 적 원인을 탐구하기 위해 웨스를 고용했지만 새로운 침묵의 돌연변이를 발견했습니다. 다행히도,우리는 침묵의 돌연변이가 새로운 5’스플 라이스 사이트를 만들었고 디엠이라는 것을 증명했습니다.

이 연구에서 다섯 명의 고통받는 태아는 모두 남성이며,이는 상속 패턴과 일치합니다. 태아 초음파 검사 및 자기 공명 영상은 전형적인 엘 1 질병을 보여줍니다. 그것은 유전자형–표현형 상관 관계에 대한 우리의 이해를 향상시킵니다.단백질 서열에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다. 그러나 다른 무성 돌연변이,다.924 다.>티.645 다.>티.645 다.>티. 1998;보스 외., 2010). 기음.2017 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월 15 일,2018 년 12 월, 1998). C.645CT L1CAM,51bp 삭제되었으로의 활성화는 새로운 exon6/intron6 증 splice(Vos et al., 2010). 우리의 현재의 연구는 유사했다;의 돌연변이 씨.453 지>티 정상 엑손 5/인트론 5 스플 라이스 사이트에서 상류 잠재적 인 5’스플 라이스 사이트를 만들었습니다. 이 모든 조용한 돌연변이는 새로운 기증자 스플 라이스 사이트를 만들어 엑손을 건너 뛰었습니다. 그것은 단백질의 접합에 영향을 미칠 수있는 이러한 침묵 돌연변이에주의를 지불하는 우리를 상기시켰다.

막 횡단 당 단백질 및 세포 접착 분자의 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 일원으로서,엘 1 캠 단백질은 다수의 상이한 당 단백질과 세포 표면에서 상호 작용할 수 있으며,동질성 결합은 아마도 상호 작용의 주요 모드 일 것이다(웨이 및 류,2012). 뉴로파신에서 이그-유사 도메인 1-4 의 결정 구조에 대한 연구는 많은 병리학 적 돌연변이가 이러한 도메인 내에서 보존 된 아미노산 잔기에 영향을 미치고 동질성 상호 작용을 방해한다고 제안했다(리우 외. 2011),특히 같은 도메인 2(자오 등의 기능 연구에 의해 확인., 1998). 우리의 연구에서는,우리는 추측 하 고 그.453 그램>티 1 캠 단백질의 세포 외 부분에 변경 된 유전자 같은 도메인 2,비정상적인 세포 외 상호 작용을 선도 하류 신호 경로 시작 시작 실패. 이 변종의 질량 분석에 전념 한 추가 연구는 세포에서 어떤 분자 앙상블이 생성되는지 구체적으로 명확히 할 것입니다.

요약하면,웨스를 통해,우리는 새로운 침묵 돌연변이를보고했다. 이 비정상적인 단백질 변이체는 유전자 유사 도메인 2 를 변경하는 것으로 예측되었습니다. 또한,우리는 수 두 증으로 5 연속 임신을 보고 하는 임신한 여자에 대 한 태아 유전자 진단을 수행. 한편,웨스에서 검출 된 일부 침묵 돌연변이를 무시해서는 안 제안;이러한 돌연변이의 접합 예측이 필요했다. 그것은 태아 진단 및 뇌수종의 이식 전 태아 진단을위한 새로운 유전 적 기초를 제공했습니다.

데이터 가용성

이 연구에서 공개적으로 사용 가능한 데이터 세트를 분석했습니다. 이 데이터는 여기에서 찾을 수 있습니다.

윤리 성명

중국 절강 대학교 의과 대학 여성 병원 검토위원회에서 인간 참가자를 대상으로 한 연구를 검토하고 승인했습니다. 이 연구에 참여하기위한 서면 동의서는 참가자의 법적 보호자/친척에 의해 제공되었습니다. 서면 동의는이 문서에 포함 된 잠재적으로 식별 할 수있는 이미지 또는 데이터의 게시를 위해 개인(들),미성년자(들)의 법적 보호자/친족에서 얻은 것입니다.

저자 공헌

나는 그림을 준비했다. 맥과 일리는 웨스 데이터를 분석했다. 그 결과,핵형 분석 및 핵형 배열이 수행되었다. 예 샘플을 모집했습니다. 헥토리털과 플로리다는 영상 검사를 제공했습니다. 이 원고를 작성했습니다. 모든 저자는 최종 원고를 읽고 승인했습니다.

자금

이 연구는 절강성의 주요 연구 개발 프로그램 인 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 제 81801441)에 의해 지원되었습니다. 2019 년 03025 년),중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(보조금 제 2016 호 1000703 호)및 절강 성 의학 과학 연구 재단(보조금 제 2014 년 246 호).

이해 상충 성명

저자는 연구가 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

감사

이 연구에 등록 된 환자에게 감사드립니다. 우리는 박사 감사합니다. 이 원고를 준비하는 동안 그의 도움을 위해.

보충 자료

이 기사의 보충 자료는 다음에서 온라인으로 찾을 수 있습니다: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2019.00817/full#supplementary-material

그림 에스 1/웨스에 의한 병원성 변이체 식별 가능성을 찾기위한 분석 전략.2014 년 11 월 15 일(토),2015 년 11 월 15 일(일),2015 년 11 월 15 일(일),2015 년 11 월 15 일(일)

표 에스 1|변이 주파수,변이 상태 및 상속 모드의 스크리닝을 통한 변이체 목록.뇌수종 관련 유전자는 뇌수종 관련 유전자와 관련이 있습니다.2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일. 자동 돌연변이,C924T(G308G),에 L1CAM 유전자에서 결과 X 연결된 뇌수종(모). 제이 메드. 제네트 35 (6), 456–462. 도이:10.1136/제이미.35.6.456

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