met behulp van de DBE-techniek verzamelden we systematisch biopten uit het gehele menselijke darmkanaal en kenmerkten we de distributie van enteroendocriene K-en L-cellen en de expressie van hun hormonale producten bij gezonde individuen en individuen met type 2 diabetes.Aangezien type 2-diabetes overgewicht/obesitas en disfunctionele glucosehomeostase impliceert die kan correleren met veranderingen in de enteroendocriene K-en L-cellen, werd de studie opgezet om het distributiepatroon van deze cellen en de expressie van sommige van hun producten te beschrijven in de twee prospectief aangeworven, even grote, goed gedefinieerde en overeenkomende groepen vrijwilligers zonder bekende gastro-intestinale stoornissen. Met behulp van DBE was het mogelijk om een groot aantal monsters in het hele darmkanaal te verkrijgen: uit negen anatomisch specifieke regio ‘ s (Fig. 1) en 7-22 ‘stations’ langs de jejunum en ileum. De biopten van de anatomisch goed gedefinieerde gebieden waren zeer vergelijkbaar. Er bestaat een grotere onzekerheid over biopsie locaties in het jejunum en proximale ileum (biopsie locaties 3-9, Fig. 1) door de variabele lengte van de intubatie en dus het aantal monsters tussen individuen. Om dit probleem aan te pakken, verdeelden we systematisch het jejunum en het ileum in zeven regio ‘ s (zie methoden). De submucosale inkt die tijdens anterograde enteroscopie op de maximale inbrengdiepte werd geplaatst, werd tijdens retrograde enteroscopie bij vier van de 24 individuen gezien, wat wijst op totale enteroscopie (Fig. 2). Aangenomen wordt dat het grootste deel van het darmkanaal in de rest van de deelnemers onderzocht is op basis van de lengte van de bereikte intubatie (voor details, zie onze methodiek paper ).
we gebruikten immunohistochemie en celtelling om de entero-endocriene cellen en prohormonenverwerkende enzymen te kwantificeren, en qPCR mRNA-expressieanalyse om de hormonale/enzymatische producten te evalueren. Beide methoden zijn goed ingeburgerd maar vormen ook beperkingen. Een hoge specificiteit van antilichamen die in immunohistochemie worden gebruikt is van groot belang om een minimum van niet-specifieke kleuring (valse positieven) te verzekeren. Daarom kozen we voor antilichamen die goed zijn vastgesteld en goed gekarakteriseerd . Met behulp van immunohistochemie en celtelling van microfotografen van gesneden biopten, worden driedimensionale objecten (d.w.z. enteroendocriene cellen) geëvalueerd met een tweedimensionale beeldvormingstechniek. Een meer optimale techniek voor de evaluatie van de celdistributie zou stereologie zijn, waarin de werkelijke dichtheid (d.w.z. cellen/mm3 weefsel) wordt geschat . Deze techniek zou echter volledige transversale ‘blokken’ van weefsel vereisen, wat onverenigbaar is met het grote aantal biopsieplaatsen, en dus gedetailleerde kartering van het darmkanaal bij levende mensen die in deze studie werd beoogd. Bovendien moet rekening worden gehouden met het volgende. Ten eerste geeft de evaluatie van de mRNA-expressie de activiteit van endocriene cellen aan, maar levert geen maat op voor de totale productie van een bepaald celproduct, aangezien niet alle mRNA wordt vertaald in een definitief actief product. Ten tweede, is de uitdrukking relatief aangezien de specifieke mRNA-afschriften met de uitdrukking van een stabiel uitgedrukt gen worden gerelateerd (zie ESM-methodes voor verdere details). Gezien de biologische heterogeniteit van type 2 diabetes, zouden mogelijk meer uitgesproken verschillen zijn gedetecteerd met een grotere steekproefgrootte en inclusie van patiënten met uitgebreidere glucose dysregulatie.
het werk van Sjölund et al uit 1983 over de verdeling van entero-endocriene cellen is tot nu toe het meest gedetailleerd uitgevoerd in de menselijke darm met IHS met een breed scala aan antisera (25 soorten) tegen bekende of voorgestelde darm neurohormonale peptiden . Minimaal invasieve technieken waren op dat moment niet beschikbaar. Dienovereenkomstig werden monsters uit slechts zeven regio ‘ s gehaald: proximale en distale twaalfvingerige darm, mid-jejunum, distale ileum, oplopende colon, distale deel van transverse colon of sigmoid colon en rectum. Voor elke regio werd weefselmateriaal verkregen van 9-17 individuen. De monsters werden teruggevonden tijdens abdominale chirurgie (voornamelijk uitgevoerd als gevolg van maligniteit) of tijdens enteroscopische onderzoeken waarbij biopten betrokken waren bij personen met ‘andere gastro-intestinale stoornissen’, waaronder een verscheidenheid aan niet-gespecificeerde symptomen en ziekten (bijvoorbeeld ‘occulte bloeding’ en ‘leverziekte’). In 1985 gebruikten Adrian et al een radioimmunoassay techniek om de hoeveelheid PYY in de maag fundus en antrum, duodenum, jejunum, ileum, ascending colon, sigmoid colon en rectum te bepalen . Monsters van elke locatie werden verkregen van 5-8 personen die een operatie ondergingen als gevolg van carcinoom of maagzweren. In 1992, werd een studie die de distributie van enteroendocriene l cellen in mensen onderzocht gemeld door Eissele et al . Er werden monsters genomen uit zeven regio ‘ s: twaalfvingerige darm, proximale en distale jejunum, ileum, oplopende dikke darm, transversale dikke darm en rectum. De monsters werden verkregen van slechts vijf deelnemers die een operatie ondergingen voor carcinoom of de ziekte van Crohn. In 2005 onderzochten Guedes et al de distributie van respectievelijk GIP-, GLP-1 – en CgA-positieve cellen, met behulp van IHS op monsters van elke 20 cm van de dunne darm in 30 menselijke kadavers .
er dient te worden benadrukt dat de vier bovengenoemde studies normaal verschijnende weefselmonsters hebben onderzocht zonder tekenen van pathologische veranderingen. De aanwezigheid van maligne of inflammatoire veranderingen in het intestinale gebied of het snelle begin van celdegradatie post mortem kan echter van invloed zijn geweest op de Algemene entero-endocriene celdistributie en-functie. Bovendien kan de heterogeniteit van de deelnemers de resultaten hebben beïnvloed.
in overeenstemming met onze resultaten beschreven Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al en Guedes et al respectievelijk variatie in L-celproducten (GLP-1 en/of PYY) afhankelijk van de darmlokalisatie, met een hogere dichtheid/hoeveelheid in het distale jejunum en het ileum vergeleken met het duodenum en het proximale jejunum, en een toenemende dichtheid/hoeveelheid van proximaal naar distaal colon, met de hoogste niveaus in het rectum . Onze resultaten ondersteunen dit l-cel distributiepatroon bij gezonde individuen en bij type 2 diabetes, met toenemende GCG en PYY genexpressie, evenals toenemende dichtheid van GLP-1 en PYY-positieve cellen, langs de dunne darm en langs de dikke darm. We observeerden ook het grootste signaal van L-celmarkers (PYY – en GLP-1-positieve cellen en PYY mRNA-expressie) in het rectum, met uitzondering van de expressie van GCG. De implicaties-indien aanwezig-van de waargenomen verschillen tussen groepen (significant grotere GCG en PYY expressie in de dikke darm van deelnemers met type 2 diabetes in vergelijking met gezonde individuen) zijn momenteel onbekend. Het is duidelijk dat het incretine-effect bij type 2-diabetes afneemt en er is gesuggereerd dat een defect in de door nutriënten geïnduceerde GLP-1-secretie dit fenomeen kan verklaren. Studies naar GLP – 1-responsen op nutriëntenprikkels bij personen met type 2-diabetes en personen zonder diabetes hebben echter aangetoond dat personen met type 2-diabetes in het algemeen geen verminderde totale GLP-1-Respons in plasma vertonen .
we hebben een discrepantie waargenomen tussen GCG-expressieniveaus en dichtheid van GLP-1-positieve cellen langs de darm. Dit benadrukt dat L-cellen in een deel van de dunne darm zich anders kunnen gedragen dan enteroendocriene l-cellen in een ander deel van de dunne darm, zoals gesuggereerd door Svendsen et al, die merkten dat het secretiepatroon van L-cellen verandert langs het maagdarmkanaal bij ratten, dat wil zeggen dat L-cellen verschillende verhoudingen van PYY en GLP-1 afscheiden, waarbij sommige alleen GLP-1 afscheiden . In overeenstemming met deze bevindingen is het waarschijnlijk dat meer distaal gelegen l-cellen proglucagon in hogere mate tot expressie brengen dan meer proximaal gelegen l-cellen.
onze bevindingen van een grotere GIP-expressie en dichtheid van GIP-positieve cellen in het proximale deel van de dunne darm, die zowel distaal afnemen tot het ileocaecale gebied bij gezonde individuen als bij patiënten met type 2 diabetes, zijn in lijn met eerdere bevindingen . In tegenstelling tot Sjölund et al , die GIP-positieve cellen afwezig vonden in de dikke darm, waren we in staat om lage niveaus van GIP-positieve cellen in het distale deel van het darmkanaal te detecteren. We kunnen echter niet uitsluiten dat dit een gevolg is van niet-specifieke antilichaambinding. Nochtans, observeerden wij mRNA uitdrukking van GIP in de dikke darm van beide groepen, zij het bij zeer lage niveaus. De expressie van GIP was significant groter bij personen met type 2 diabetes langs het gehele darmkanaal. Er kan worden gespeculeerd dat de transcriptie van GIP wordt verhoogd als een compenserend resultaat van GIP resistentie, dat wil zeggen het verminderde insulinotrope effect van GIP waargenomen bij personen met type 2 diabetes . In overeenstemming hiermee is aangetoond dat nuchtere GIP-spiegels hoger zijn bij deelnemers met type 2-diabetes in vergelijking met deelnemers met niet-diabetische controle , en bovendien is voorgesteld dat GIP bijdraagt aan de hyperglykemie die bij type 2-diabetes wordt waargenomen (voornamelijk als gevolg van het glucagonotrope effect van GIP) . Gegevens over GIP-responsen na orale glucose of gemengde maaltijden bij personen met diabetes type 2 zijn echter inconsistent geweest, en een systematische beoordeling met meta-analyse heeft gesuggereerd dat postprandiale GIP-responsen vergelijkbaar zijn bij personen met diabetes type 2 en gezonde personen .
aangezien het zure glycoproteïne CgA een bestanddeel is van celblaasjes en geacht wordt meerdere rollen te spelen in het secretieproces van endocriene producten, wordt het gebruikt als algemene marker van entero-endocriene cellen . In tegenstelling tot Guedes et al die een constante dichtheid van CGA-positieve cellen langs de dunne darm waarnamen, toonde onze studie een significante afname. Verder zagen we een grotere dichtheid van CGA-positieve cellen in de dunne darm van gezonde individuen dan deelnemers met diabetes type 2. Er zou kunnen worden gespeculeerd dat het totale aantal CGA-positieve cellen (enteroendocriene cellen) wordt veranderd in type 2 diabetes—hetzij als gevolg van de type 2 diabetische toestand of, misschien, bij te dragen aan de pathogenese van type 2 diabetes. We zagen vrij hoge aantallen CgA-positieve cellen in het rectum van beide groepen. Onlangs toonden Engelstoft et al bij muizen aan dat CgA voornamelijk gelokaliseerd was voor monoamine-afscheidende enteroendocriene cellen en spaarzamer voor peptide-afscheidende enteroendocriene cellen , misschien ondersteunend het voorstel van Sjölund et al dat de rectale enteroendocriene cellen een primair lokale (paracrine) functie in plaats van systemische functie zouden kunnen hebben .
omdat bekend is dat PC1/3 prohormonen verwerkt die leiden tot de vorming van respectievelijk GIP en GLP-1, verwachtten we de aanwezigheid van PC1/3 langs het gehele darmkanaal te vinden. We respectievelijk waargenomen een discrepantie met betrekking tot grotere expressie van PCSK1 / 3 en lagere dichtheid van PC1 / 3-positieve cellen in de dunne darm van deelnemers met type 2 diabetes in vergelijking met gezonde deelnemers. Zoals hierboven uiteengezet, moet deze bevinding worden geïnterpreteerd met het oog op het feit dat sommige entero-endocriene cellen in sommige regio ’s zeer actief kunnen zijn en in andere regio’ s een lage activiteit hebben.
aangezien PC2 voornamelijk bekend is voor de verwerking van proglucagon tot glucagon in alfacellen in de pancreas, was het interessant om mRNA-expressie te vinden van pcsk2-en PC2-positieve cellen langs het gehele darmkanaal. Dit zou erop kunnen wijzen dat glucagon in de darm wordt geproduceerd, zoals onlangs door Lund et al wordt gesuggereerd . In overeenstemming hiermee kan worden gespeculeerd dat de grotere pcsk2-expressie in de dunne darm van personen met type 2 diabetes leidt tot de vorming van overtollig glucagon, wat bijdraagt aan type 2 diabetische hyperglycemie. Om dit aspect verder te verduidelijken, zijn studies met inbegrip van immunohistochemische dubbel-kleuring gerechtvaardigd.Concluderend kan worden gesteld dat de huidige kartering van de verdeling van de enteroendocriene K-en L-cellen en de waargenomen variaties in expressieniveaus van hun verwante producten langs het menselijke darmkanaal, gecombineerd met de aangetoonde verschillen tussen deelnemers met type 2 diabetes en gezonde personen, een naslagwerk vormen voor wetenschappers en clinici. In combinatie met de kennis van fysiologische studies over circulerende darmhormonen, kunnen onze gegevens van waarde zijn om te begrijpen hoe de darm bijdraagt aan de regulering van het glucosemetabolisme en de eetlust. Identificatie van PC2 in enteroendocriene cellen is interessant omdat dit consistent zou kunnen zijn met de vorming van glucagon in de menselijke darm. Er zijn echter verdere studies nodig om deze mogelijkheid te bewijzen en onze bevindingen te koppelen aan de pathofysiologie van type 2 diabetes.
