de biokatalytische toepassingen voor enzymen zijn de laatste jaren enorm gegroeid omdat ze ecologisch correct zijn, een hoge specificiteit hebben, chemo-regio-enantio-selectiviteit vertonen en een grote diversiteit aan reacties vertonen. Bovendien zijn de voorwaarden voor het verkrijgen en optimaliseren van de productie van enzymen in termen van voedingsstoffen, pH, temperatuur en beluchting gemakkelijk te controleren in bioreactoren. Micro-organismen kunnen ook genetisch gemanipuleerd worden om de gewenste eigenschappen van een biokatalysator te verbeteren. Deze eigenschappen hebben de steeds groeiende zoektocht naar biokatalytische processen aangemoedigd . Het doel van onze studie was om een enzymatisch proces te gebruiken om keratine hydrolysaten te verkrijgen voor haarverzorgingsproducten. Momenteel worden de commerciële keratinehydrolysaten verkregen door chemische hydrolyse. De voorgestelde methode is milieuvriendelijk en produceert een helder hydrolysaat. De commerciële hydrolysaten hebben daarentegen een donkere kleur door de aanwezigheid van zuur. De heldere kleur is een voordeel bij het opnemen van keratine hydrolysaat in producten voor haar of huid cosmetica. Wei-eiwitten met een molecuulmassa lager dan 10 kDa worden gekenmerkt door verminderde allergeniciteit. Daarom is het wenselijk om fracties met een molecuulmassa van minder dan 5 kDa in het hydrolyseproces te verkrijgen . Daarnaast toonden Eremeev et al de antioxiderende werking van keratinehydrolysaten aan. De eerste stap in dit werk bestond uit het transformeren van veren in keratinepeptiden en aminozuren door peptidasen en keratinasen geproduceerd door Bacillus subtilis. Figuur 3 laat zien dat de veren werden afgebroken (90-95%) door het micro-organisme na vijf dagen groei in het medium. De keratinases en peptidases kunnen op andere keratinresiduen met inbegrip van wol en hoornpoeder inwerken. Keratinasen worden toegepast in de voer -, kunstmest -, wasmiddel -, leer-en farmaceutische industrie .
a controle: Bacillus subtilis in vedermedium (tijd 0) en B na 5 dagen groei in vedermedium.
sommige rapporten hebben de productie van keratinasen beschreven door Bacillus soorten zoals B. subtilis KD-N2; B. pumilus KS12, B. megaterium SN1 . Deze werken beschrijven echter de isolatie van nieuwe stammen, de productie van mutanten en de karakterisering van keratinases die de mogelijke toepassingen ervan suggereren. In onze studie lag de nadruk op het veerkeratinehydrolysaat geproduceerd door B. subtilis, in het bijzonder de peptiden, en het doel van ons werk was om het effect van het hydrolysaat op haarvezel te analyseren. Verschillende methodologieën voor keratinases analyse zijn gebruikt door andere auteurs en deze grote variabiliteit maakt het moeilijk om resultaten te vergelijken. De inheemse stam van Bacillus subtilis die in het huidige manuscript wordt gebruikt vertoonde echter een uitstekende proteolytische (gelatinase) activiteit met een productie van respectievelijk 350 U/ml en 400 U/ml keratinasen en proteasen.
de keratinepeptiden gevormd door enzymatische afbraak werden geanalyseerd met behulp van Matrix-assisted laser desorption /ionization –time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie. Allereerst kunnen we door de twee spectra te vergelijken de verschillende profielen van de twee hydrolysaten waarnemen. De verschillende pieken die overeenkomen met de peptiden met een laag moleculair gewicht, voornamelijk in het bereik van 800 tot 1079 m/z, werden geproduceerd door Bacillus subtilis (figuur 4A). We kunnen ook enkele ionen waarnemen met m / z in het bereik van 1171,57 tot 1758,96. Terwijl voor het in de handel verkrijgbare keratinehydrolysaatpreparaat KH1 de pieken geconcentreerd waren in het bereik van 900 tot 1400 m / z, zoals weergegeven in Figuur 4 (B). Meerdere pieken tussen 1400 en 2100 zijn ook te zien in dezelfde figuur. Aldus bevat het hydrolysaat dat door B. subtilis wordt geproduceerd peptides met lagere moleculaire massa ‘ s. Deze laagmoleculaire peptiden kunnen efficiënter doordringen in de haarvezel en dit kenmerk is een positief verschil in vergelijking met de commerciële hydrolysaten. Een eerder werk van onze groep met behulp van menselijk haar als substraat toonde meerdere pieken van 816 tot 2080 m⁄z na 4 dagen van cultuur . De molecuulmassaanalyse van het supernatans van de kweek geproduceerd door de B.subtilis stam SLC met veren als substraat toonde aan dat de meeste peptiden, afgeleid van kippenveren, een molecuulmassa hadden van 500-3000 Dalton . In een thermofiele Meiothermus ruber h328, ontdekte de MALDI TOF analyse van opgeloste producten na de groei op vedermedium slechts oligopeptiden met minder dan 1.000 Dalton . Deze resultaten bevestigen dat de microbiële enzymen peptides met een lagere moleculaire massa produceren.
MALDI-TOF MS analyse van de enzymatische keratine hydrolysaten uit veer keratine door Bacillus subitilis (A) en een commercieel hydrolysaat (KH1) (B). Voor details zie materialen en methoden.
een voorlopige analyse van de enzymatische keratinehydrolysaten werd uitgevoerd met behulp van dunnelaagchromatografie (HPTLC) en peptiden en aminozuren met een lagere moleculaire massa werden waargenomen zoals getoond in Figuur 5, rijstrook 2, in vergelijking met het commercieel hydrolysaat (KH1) in rijstrook 3. Het aminozuur glycine in baan 1 werd standaard gebruikt.
hptlc analyse van keratine peptiden na filtratie door ultrafiltratie in het Amicon systeem (Millipore, 1000 Dalton). 1-aminozuur glycine. 2-Feather keratine peptiden verkregen door enzymatische hydrolyse. 3-Commercieel hydrolysaat (KH1).
na de gisting had het enzymatische hydrolysaat een eiwitconcentratie van 3,5 mg / ml. Na filtratie ging het eiwitgehalte naar 1,5 mg/ml,wat overeenkomt met een percentage van 42,8% ten opzichte van het totale eiwit. Het enzymatische hydrolysaat werd op de haarlokken aangebracht in een concentratie van 10%, zoals beschreven in materialen en methoden en in Figuur 2.
het hydrolysaat werd aangebracht met een milde shampoo en een conditioner voor het spoelen, bereid volgens de tabellen 1 en 2. Tabel 3 toont aan dat er een toename van de hydratatie is voor al het haar behandeld met de enzymatische hydrolysaten en met stijltang bij 180°C. Zonder de toepassing van warmte was het proces niet efficiënt, wat suggereert dat verwarming belangrijk is om de hydrolysaten in het haar op te nemen.
eiwithydrolysaten, met name die met een laag moleculair gewichtsverdeling-d.w.z. < 1.000 Dalton-zijn bekend om hun efficiënte bescherming en verzorging. Diverse bronnen van proteã nen zijn gebruikt om hydrolysaten te produceren. Tarwe-eiwit, wol keratine en collageneuze hydrolysaten zijn voorbeelden die zijn gebruikt in huid-en persoonlijke haarverzorgingsproducten en waarvan bekend is dat ze verbeterde compatibiliteit, gevoel, hydratatie verlenen en helpen de natuurlijke structuur te behouden . In haarverzorgingsproducten hebben de peptiden van het lagere molecuulgewicht twee effecten: 1) ze kunnen de cortex van de haarvezel penetreren en 2) Ze kunnen een oppervlaktelaag bevorderen. De penetratie lijkt dieper te zijn bij langere behandelingen. Daarnaast vertoont gebleekt haar een hoger niveau van penetratie van hydrolysaten in vergelijking met niet-beschadigd controlehaar . Deze eigenschappen hebben gunstige effecten op de haarstructuur ter vervanging van verloren keratine en hebben ook een anti-aging effect . Het effect van keratinepeptide van wol op de huid in een waterige formulering of in liposomen werd onderzocht door en een toename van hydratatie en elasticiteit als gevolg van de keratinepeptide toepassing werd waargenomen.
het effect van de toepassing van het enzymatische hydrolysaat op haarvezel werd beoordeeld door SEM (figuren 6, 7 en 8). Alle cijfers tonen micrografen van haarvezels behandeld en onbehandeld met de enzymatische hydrolysaat. Een toename van de helderheid en zachtheid werd waargenomen door sensorische analyse (gegevens niet getoond). Echter in de micrografen werden afzettingen van veerkeratine hydrolysaten waargenomen in de kruising van de nagelriemen van alle haartypes. Deze afzetting draagt waarschijnlijk bij aan de afdichting van de nagelriemen. Ook warmte is essentieel voor de volledige afdichting van de nagelriemen. Gekleurde vezel werd geprofiteerd door de hydrolysaten wanneer toegepast met warmte (figuur 6C, D). Hydrolysaten hechtten zich meer aan de eerder gekleurde en rechtgetrokken haarvezels (figuur 7C, D), wat aangeeft dat de combinatie van kleuring en rechttrekken de werking van de keratinepeptiden bevordert. Figuur 8 (A, B) laat zien dat de bleekbehandeling geaccentueerde schade aan de haarvezel bevorderde. Het uiterlijk van de voorrand van de schubben wijst op een breuk van de schubben (B). De toepassing van de enzymatische hydrolysaten met warmte werkte samen voor de afdichting van de nagelriemen, maar hun randen bleven gebroken (C, D).
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse van gekleurd haar A, B –Controle; C, D-na de behandeling met de enzymatische hydrolysaten en stijltang bij 180°; E, F – na de behandeling met de enzymatische hydrolysaten zonder warmte. Pijlen wijzen op feather enzymatic hydrolysate afzettingen.
SEM Micrografie analyse van gekleurd en recht haar na enzymatische hydrolysaat behandeling. Behandeld haar A, B-Controle; C, D – na behandeling met de enzymatische hydrolysaten en stijltang op 180°; E, F – na behandeling met de enzymatische hydrolysaten zonder warmte, noteer de neerslag van de enzymatische hydrolysaten op de schalen (pijl).
elektronische scanning microscoopbeelden verkregen van onbehandeld gebleekt haar (A, B) en behandeld met de enzymatische hydrolysaten met warmte (C,D) of zonder warmte (E,F). Zwarte pijl geeft aan dat peptiden uit de enzymatische hydrolysaten worden afgezet en witte pijl toont de gebroken randen van de cuticula.
wanneer haarchemie wordt gewijzigd, worden sommige van de natuurlijke eigenschappen van haar aangetast. Verschillende mechanismen kunnen schade aan haarvezel veroorzaken. Bijvoorbeeld, milieu spanningen en UV straling foto-oxideert eiwitten. Eiwit foto-oxidatie leidt tot de splitsing van disulfide banden die cross-link de eiwitten, en het breken van thioester banden, wat resulteert in de release van gebonden oppervlakte lipiden en verlies van haarstructuur. Deze reacties leiden tot een verslechtering van de haareigenschappen, merkbaar voor consumenten in de vorm van slechte beheersbaarheid, droogte en broosheid, verlies van glans en, in extreme gevallen, verminderde kracht . Sommige cosmetische behandelingen zoals permanente krullen, permanente kleuren, bleken en ontspannen/rechttrekken zijn bekend om haar eigenschappen te veranderen . Zelfs cosmetische behandeling zoals dagelijks kammen en borstelen kan haar beschadigen . Onlangs gebruikten Cao et al verschillende concentraties van de gistingsbouillon (kippenveren) verkregen uit Stenotrophomonas maltophilia, in het haar. Het supernatant werd gedurende 30 minuten geïncubeerd. De bouillon werd gevonden om Beschermend aan haar te zijn, zoals blijkt uit de verbeterde flexibiliteit en sterkte voor zowel normaal als beschadigd haar.
Sionkowska, et al.evalueerden met behulp van UV–Vis-spectroscopie, Fouriertransformatiespectroscopie, infraroodspectroscopie (FTIR) en fluorescentiespectroscopie de invloed van UV-straling op keratinehydrolysaten. Nieuwe fotoproducten werden gevormd tijdens UV-bestraling van keratinehydrolysaten en een lichte toename van geoxideerde zwavelsoorten werd ook waargenomen. De auteurs stelden voor dat fotodegradatie van keratinehydrolysaten een nuttige methode zou kunnen zijn voor de bereiding van hydrolysaten met een lager moleculair gewicht. In het huidige werk werd een verhoging van de hydratatie, helderheid en zachtheid waargenomen in de verschillende haartypes na de behandeling met 10% keratinepeptiden verkregen door het enzymatische hydrolyse proces. Het gebruik van veren, een industrieel afval van gevogelte als biomassabron voor het proces is zeer interessant omdat deze grondstof goedkoop is en bio wordt omgezet in een nieuw product met een geaggregeerde waarde. Momenteel worden keratine hydrolysaten meestal bereid uit keratine bevattende dierlijke delen, zoals veren, hoorns, hoeven, haar en wol. Aromatische aminozuren (tryptofaan, tyrosine en fenylalanine) en cystine (aminozuur met zwavel) spelen een centrale rol in de fotochemie van keratine . Sommige industrieën hebben producten ontwikkeld die een complex van 18 vrije aminozuren uit tarwe -, maïs-en soja-eiwitten gebruiken om de natuurlijke samenstelling van keratine na te bootsen. Het hoge zwavel aminozuurgehalte van de soja is vergelijkbaar met dat van mensenhaar en wol . Keratine is echter een onvervangbaar eiwit met betrekking tot zijn mechanische en beschermende eigenschappen.
de in deze werkzaamheden beschreven enzymatische methode kan voor industrieel afval/residuen in het algemeen worden gebruikt om producten met een toegevoegde waarde te produceren. Eerdere studies in de literatuur hebben het gebruik van keratinasen /peptidasen beschreven voor het recyclen van veerkeratine die door de pluimvee-industrie wordt weggegooid . Het huidige werk rapporteert voor het eerst over het gebruik van keratinepeptiden in de cosmetische industrie, speciaal gericht op het haarverzorgingssegment. Rekening houdend met al deze factoren, is de enzymatische methode voor keratine peptide productie voor haarverzorgingsproducten een aantrekkelijke en milieuvriendelijke methode met groot potentieel binnen de cosmetische industrie.
