totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van Tripure Isolatiereagens (Roche).
RNA-monsters werden behandeld met RNase-vrije DNaseI en gezuiverd met behulp van de RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Het resulterende RNA was uitgeput van ribosomaal RNA door gebruik te maken van Ribo-Zero rRNA Verwijderingsset (mens/Muis/Rat) (epicentrum). Het rRNA-verarmd RNA werd gebruikt om de eerste bundel cDNA te synthetiseren gebruikend SuperScript® III eerst-Bundelsynthesesysteem (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikanten. Vervolgens werd de tweede streng gegenereerd door het gebruik van E. coli DNA ligase (Invitrogen), E. coli DNA polymerase (Invitrogen), en dUTP, dCTP, dATP en dgtp set (10 µmol elk, Promega), in de tweede bundel Buffer (Invitrogen). Daarna werden de cDNA geschoren met Covaris tot ongeveer 300bp. Na fragmentatie werden de monsters gezuiverd met MinElute kolommen (Qiagen). En de uitstekende 3 ‘en 5′ einden van de fragmenten werden hersteld gebruikend de Polymerase van T4 DNA (NEB) en het Polynucleotidekinase van T4 DNA (NEB) in de ligasebuffer van T4 DNA (NEB). Vervolgens werden dA-einden gegenereerd door gebruik te maken van Klenow-Fragment (3′ ->5’ exo -, NEB), in Buffer 2 (NEB). Adapter ligation reacties werden toen opgezet gebruikend geïndexeerde adapters en snelle Ligase (NEB). De producten werden gebruikt als malplaatje voor UNG (Fermentas) behandeling en PCR versterking met behulp van Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). De bibliotheken werden gevisualiseerd op 2% E-Gel® General Purpose Agarose Gels (Invitrogen). De barcoded bibliotheken werden gesequenced op een enkele rijstrook van een Hiseq2500 (Illumina).
