Het neerhalen en neerhalen van genen

het neerhalen van genen
deze techniek maakt het mogelijk de expressie van een of meer van een organisme te verminderen. Dit kan door genetische modificatie of door behandeling met areagent zoals een kort DNA of RNA oligonucleotide voorkomen dat een opeenvolging complementary aan of gen of een mRNA-transcript heeft.
als de verandering in de genexpressie wordt veroorzaakt door een oligonucleotide die aan een mRNA bindt of Tijdelijk aan een gen bindt, leidt dit tot een tijdelijke verandering in de genexpressie die het chromosomale DNA niet wijzigt,en het resultaat wordt een “transiënte knockdown”genoemd.
bij een tijdelijke knock-down veroorzaakt de binding van dit oligonucleotide aan het activegene of zijn transcripten een verminderde expressie. Binding kan optreden door het blokkeren van transcriptie, de afbraak van het mRNA-transcript (bijv. siRNA of RNase-h afhankelijke antisense), of door het blokkeren van hetzij mRNA vertaling, pre-mRNA splicing sites, of nuclease splitsingsites gebruikt voor rijping van andere functionele RNAs, met inbegrip van miRNA (e.g.by morpholino oligos).
het meest directe gebruik van transiënte knockdowns is om te leren over een gen dat is gesequenced, maar een onbekende functie heeft. Deze experimentele benadering staat bekend als reverse genetics. Transiënte knockdowns worden vaak gebruikt in de ontwikkelingsbiologie omdat oligosin eencellige zygoten kunnen worden geïnjecteerd en aanwezig zullen zijn in de dochtercellen van de geïnjecteerde cel.RNA-interferentie (RNAi) is een middel om genen tot zwijgen te brengen door degradatie van mRNA. Gen knockdowndoor deze methode wordt bereikt door kleine double-stranded interferingRNAs (siRNA) in het cytoplasma te introduceren. Eenmaal geà ntroduceerd in de cel, worden exogenoussiRNAs verwerkt door RISC. De siRNA is complementair aan de te zwijgen targetmRNA, en het RISC gebruikt de siRNA als een sjabloon voor het lokaliseren van het doel mRNA. Nadat RISC aan doel mRNA lokaliseert, wordt RNA gespleten door een ribonuclease.
RNAi wordt gebruikt voor genetische functionele analyse. Het gebruik van RNAi kan nuttig zijn in het identificeren van potentiële therapeutische doelstellingen, drugontwikkeling, of andere toepassingen.

Gene knock-out
Geneknock-Out (KO) is een genetische techniek waarbij een van de genen van een organisme buiten werking wordt gesteld. Het knockoutorganismen worden gebruikt om genfunctie te bestuderen, gewoonlijk door het effect van genverlies te onderzoeken. Heterozygote en homozygote Kos: in het eerste is slechts één allel knock-out, in het tweede zijn beide allelen knock-out.

de gerichte creatie van een KO begint in de reageerbuis met een plasmide,een bacterieel kunstmatig chromosoom of een ander DNA-construct, en leidt tot celcultuur. De cellen worden getransfecteerd met de DNAconstruct. Vaak is het doel om een transgeen dier te creëren dat het genealterde gen heeft.
zo ja, dan worden embryonale stamcellen genetisch getransformeerd en in vroege embryo ‘ s ingebracht. Resulterende dieren met de genetische verandering in hun kiembaancellen kunnen dan vaak de Gen knockout doorgeven aan toekomstige generaties.

de constructie is ontworpen om te recombineren met het doelgen, wat wordt gedaan door sequenties van het gen zelf in de constructie op te nemen.De nieuwe combinatie komt dan in het gebied van die opeenvolging binnen het gen voor,resulterend in de toevoeging van een vreemde opeenvolging om het gen te verstoren.
een voorwaardelijke knockout maakt gendeletie op een weefsel-of tijdspecifieke manier mogelijk. Dit wordt gedaan door loxP plaatsen rond het gen te introduceren. Deze gevolgen zullen via hetzelfde mechanisme als een knock-out in de kiemlijn worden ingevoerd. Deze kiemlijn kan dan aan een andere kiemlijn worden gekruist die Cre-recombinase bevat die een viraal enzym is dat deze opeenvolgingen kan herkennen, hen opnieuw combineert en het gen verwijdert dat door deze plaatsen wordt geflankeerd.
omdat de DNA-recombinatie een zeldzame gebeurtenis is, omvat de voor insertie gekozen vreemde sequentie gewoonlijk een reporter. Dit maakt een eenvoudige selectie van cellen of individuen waarin knockout succesvol was. Soms voegt DNAconstruct in een chromosoom toe zonder de gewenste homologe combinatie met het doelgen.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
het is een techniek waarmee de expressie van een gen wordt verminderd. Deze vermindering kan het gevolg zijn van een DNA-modificatie of van een oligonucleotidebinding aan mRNA of aan het gen. In dit geval is de expressieverandering tijdelijk, dus wetalk over tijdelijke knockdown.
een van de technieken die het tijdelijk uitschakelen van een gen mogelijk maken, bestaat uit het gebruik van Morfolino-oligomeren. Ze zijn een standaard knockdown toolin dierlijke embryonale systemen geworden, zodat Morpholinooligos vaak worden gebruikt om de rol van een specifiek mRNA-transcript Inan embryo te onderzoeken. Zijn moleculaire structuur heeft de basissen van DNA in bijlage aan een backbone van methyleenmorfolineringen die door phosphorodiamidate groepen worden verbonden. Morfolino ‘ s blokkeren de toegang van andere moleculen tot kleine (~25 base) specifieke sequenties van het base-pairing oppervlak van ribonucleïnezuur (RNA). Door hun volledig onnatuurlijke rugbeenderen worden Morpholinos niet herkend door cycellulaire eiwitten. Nucleasen degraderen Morfolino ‘ s niet, noch worden ze afgebroken in serum of in cellen. Er zijn geen gepubliceerde meldingen van Morfolino ‘ s die toll-achtige receptoren activeren of aangeboren immuunresponsen zoals interferon-inductie of de NF-kB-gemedieerde ontstekingsreactie.Van morfolino ‘ s is niet bekend dat ze de methylering van DNA wijzigen.
Morfolino ‘ s leiden niet tot de afbraak van hun RNA-doelmoleculen,in tegenstelling tot veel antisense structurele types (bijvoorbeeld fosforothioaten, siRNA). In plaats daarvan, Morfolinosact door “steric het blokkeren”, die aan een doelopeenvolging binnen RNA binden, remmende molecules die anders met RNA zouden kunnen interageren.
Morfolinos kunnen ook de splicing van pre-mRNA wijzigen of de verzadiging en activiteit van miRNA remmen.
blokkerende vertaling
gebonden aan de 5′-Niet-vertaalde regio van messenger RNA (mRNA), kunnen Morfolino’ s interfereren met deprogressie van het ribosomale initiatiecomplex van de 5 ‘ cap tot het startcodon. Dit voorkomt vertaling van de codering gebied van de beoogde transcript (genaamd “neerhalen”geneexpression). Dit is experimenteel nuttig wanneer een onderzoeker de functie van een bepaald eiwit wil kennen; Morpholinos bieden een geschikte manier om uitdrukking van het eiwit neer te halen en te leren hoe dat neerhalen de cellen of het organisme verandert.Morfolino ‘ s kunnen interfereren met pre-mRNA-verwerkingsstappen, hetzij door te voorkomen dat kleine nuclear ribonucleoproteïnen (snRNP) complexen zich binden aan hun doelwitten aan de grenzen van introns op een streng pre-mRNA, hetzij door de nucleofiele adeninebasis te blokkeren en te voorkomen dat deze de splice lariatstructuur vormt, hetzij door de binding van Splice regulatory proteins zoals splice silencers en splice enhancers te verstoren. Het verhinderen van de band van snRNP U1 (op de donorplaats) of U2/U5 (op de polypyrimidinedeel en de acceptorplaats) kan veroorzaken gewijzigd het verbinden, algemeen het uitsluiten exons van de aard mRNA. Het richten van sommige splice targets resulteert in intron insluitsels, terwijl activation van cryptische splice sites kan leiden tot gedeeltelijke insluitsels of uitsluitingen.Doelen van U11 / U12 snRNPs kunnen ook worden geblokkeerd. De las modificatie kan door reverse-transcriptase polymerasekettingreactie (RT-PCR)worden bepaald en wordt gezien als een bandverschuiving na gelelektroforese van RT-PCR-producten.
KNOCKOUT
een variatie van de traditionele gen knockout is de voorwaardelijke gen knockout. Conditional gene knockout is een techniek die wordt gebruikt om een specifiek gen in een bepaald weefsel, zoals de lever, te elimineren. Deze techniek is nuttig om de rol van individuele genen in levende organismen te bestuderen. Het verschilt van traditionele gen knockout omdat het specifieke genen op specifieke tijden richtenrather dan wordt geschrapt van het begin van het leven. Met behulp van de voorwaardelijke geneknockout techniek elimineert veel van de bijwerkingen van traditionele gen knockout. In traditionele gen knockout, kan de embryonale dood van een genmutatie voorkomen, en dit verhindert wetenschappers om het gen inadults te bestuderen. Sommige weefsels kunnen niet goed in isolatie worden bestudeerd, zodat moet het gen inactief zijn in een bepaald weefsel terwijl actief blijven in anderen. Met deze technologie, kunnen de wetenschappers genen in een specifiek stadium indevelopment knockout en bestuderen hoe de knockout van een gen in één Weefsel samegene in andere weefsels beà nvloedt.
de meest gebruikte techniek is het cre-lox-combinatiesysteem. Het enzym cre recombinase herkent specifiek twolox (loci van recombinatie) plaatsen binnen DNA en veroorzaakt nieuwe combinatie tussen hen. Deze nieuwe combinatie zal een schrapping of inversie van de genen tussen de twee lox plaatsen veroorzaken, afhankelijk van hun oriëntatie. Anentire gen kan worden verwijderd of geïnactiveerd. Dit hele systeem is induceerbaar zodat achemisch kan worden toegevoegd om genen op een bepaald moment uit te schakelen. Twee van de meestgebruikte chemische producten zijn tetracycline, die transcriptie van het gen van recombinase van theCre activeert en tamoxifen, die vervoer van de Proteã ne van Crerecombinase aan de kern activeert. Slechts een paar celtypes drukken Crerecombinase uit en geen zoogdiercellen drukken het uit zodat is er geen risico van accidentalactivation van lox plaatsen wanneer het gebruiken van voorwaardelijke gen knockout in zoogdieren.
een muis die het Cre-gen bevat en een muis die de loxp-sequenties bevat, worden gefokt om een voorwaardelijke knock-out te genereren voor een bepaald belangrijk eiwit. De muizen drukken niet van nature cre recombinase of loxsites uit, maar ze zijn ontworpen om deze genproducten uit te drukken om de gewenste nakomelingen te creëren. U moet een muis verkrijgen waarin een belangrijke exon is floxed (dit betekent dat het Alox-P upstream en downstream heeft) en een muis die een Cre-sequentie heeft waarvan de expressie wordt gereguleerd door een celtype-specifieke promotor of een induceerbare promotor. Dan steek je deze muizen en u krijgt een muis in de cellen niet uiten Cre zal de gene met een normale functie, terwijl de cellen van het uiten van Cre hebben een gen functie verstoord in het gedeelte tussen Lox-P.
(Francesca Luca)

RNA interferrence mechanisme

De RNA-interferentie (RNAi), anancient mobiele antivirale respons, is een natuurlijk mechanisme voor het spreekverbod geneexpression. Het kan worden uitgebuit om specifieke remming van functie van om het even welk doelgen toe te staan. RNAi blijkt om een onschatbaar onderzoekshulpmiddel te zijn, helpt het in de identificatie van nieuwe genen betrokken bij ziekteprocessen.

RNAi is niet het enige mechanisme voor het tot zwijgen brengen van genexpressie (tabel 1).

Tabel 1: vergelijking tussen verschillende methoden voor gengeluiddemping.

de interferentie van RNA (RNAi) komt in reactie op de inleiding van double-stranded RNA (dsRNA)in een cel voor. De dsRna-inleiding leidt tot de activering van dsRNA-afhankelijke eiwitkinase-R (PKR). Geactiveerde PKR fosforylaten de translatie-initiatiefactor EIF2: dit effect, in combinatie met de activatie van Rnase-L en de inductie van interferonproductie, stopt de eiwitsynthese en bevordert apoptose. Over het algemeen wordt aangenomen dat dit een antiviraldefense mechanisme vertegenwoordigt. RNAi is een hoogst behouden mechanisme door taxonomische species . Naast een antiviral activiteit hebben, wordt RNAi ook verondersteld om de uitdrukking van potentieel schadelijke segmenten van het genoom, zoals transposons te onderdrukken, die het genoom kunnen destabiliseren door als insertional mutagenen te handelen.

hoewel de mechanismen ervan niet volledig zijn opgehelderd, is RNAi het resultaat van een meerstapsproces(figuur 1). Bij het ingaan van de cel, worden lange dsRNAs eerst verwerkt door het enzym RNase III Dicer. Dit functionele dimeer bevat helicase, dsRNA binding, en PAZ domeinen (hun rollen zijn niet volledig elucided). Dicer produceert 21-23 nucleotide dsRNA fragmenten met twonucleotide 3 ‘ end overhangs, d.w.z. siRNAs. RNAi wordt bemiddeld door RNA-veroorzaakt het zwijgen complex (RISC) dat, geleid door siRNA, mRNA erkent die een gevolg homologe aan siRNA bevatten en mRNA bij een plaats splitst die ongeveer in het midden van het homologe gebied wordt geplaatst. Aldus, wordt de genuitdrukking specifiek geïnactiveerd op een post-transcriptional niveau.

In C. elegans, is Dicer getoond om met rde-proteã nen in wisselwerking te staan. De rde-proteã nen binden aan lange dsRNA en zijn believed om lange dsRNA aan Dicer voor verwerking voor te stellen. Mutanten die een hoge mate van resistentie tegen RNAi vertonen, hebben mutaties atrde-1 en rde-4 loci.

figuur 1: mechanisme van Rnainterferentie

de verschijning van doublestranded (ds) RNA binnen een cel (b. v. als gevolg van virale besmetting)leidt tot een complexe reactie, die onder andere fenomenen omvat (b. v.interferon productie en de gevolgen daarvan) een cascade van moleculaire gebeurtenissen bekend als RNAi. Tijdens RNAi, bindt het cellulaire enzym Dicer aan dsRNA en splijt het in korte stukken van ~ 20 nucleotideparen in lengte als smallinterfering RNA (siRNA) wordt bekend. Deze paren van RNA binden aan het cellulaire enzym calledRNA-veroorzaakte complex tot zwijgen brengen (RISC) dat één bundel van siRNA gebruikt om enige vastgelopen molecules van RNA (d.w.z. mRNA) van aanvullende opeenvolging te binden. De nucleaseactiviteit van RISC degradeert dan mRNA, waardoor uitdrukking van het virale gen tot zwijgen wordt gebracht. Evenzo, wordt de genetische machinerie van cellen verondersteld toutilize RNAi om de uitdrukking van endogene mRNA te controleren, waarbij een newlayer van post-transciptional verordening wordt toegevoegd. RNAi kan in de ervaringsinstellingen worden uitgebuit om doelgenen van belang met een hoogspecifieke en vrij gemakkelijke technologie neer te slaan (zie tekst voor meer details).

naast genesilencing kan RNAi betrokken zijn bij andere verschijnselen van genregulatie.. Het lijkt erop dat RNAi ook kan functioneren door cytosines te methyleren evenals CpGsequences meer klassiek geassocieerd met methylation. Als de doelsequentie homologie met een promotor deelt, kan transcriptional silencing viamethylation voorkomen. Bovendien lijkt RNA om met chromatin domeinen in wisselwerking te staan, die uiteindelijk directe methylation van DNA kunnen zijn. De Studies van C. elegans hebben aangetoond dat RNAi onder cellen door mechanismen kan verspreiden die niet op siRNA kunnen scharnieren.De systemisch RNA interferentie-deficiënte (sid) locus, sid-1, codeert een conservedproteïne met een signaalpeptideopeenvolging en 11 veronderstelde transmembraandomeinen,die suggereren dat de sid-1 proteã ne als kanaal voor lange dsRNA, siRNA,of een momenteel onontdekt RNAi-gerelateerd signaal kan handelen. Sid-1 mutanten retaincell-autonome RNAi maar niet te laten zien verspreiding van RNAi. Het blijft onduidelijk of deze systemische RNAi voorkomt in zoogdieren, hoewel een sterke gelijkenis wordt gerapporteerd tussen sid-1 en voorspelde menselijke en muisproteïnen.

(Justine Floret)

bron : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang= “en-gb” xml:lang= “nl-gb”>

ZFN , TALEN, CRIPR/CAS9

deze drie moleculaire technologieën maken het mogelijk het genoom op een locatiespecifieke manier te bewerken, waarbij elke techniek met een ander mechanisme werkt. Zink-vinger nucleases (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleases (TALENs) zijn chimerische nucleases samengesteld uit programmeerbare, sequentie-specifieke DNA-bindende modules gekoppeld aan een niet-specifiek DNA-splitsingsdomein. ZFNs en TALENs laten een brede waaier van genetische wijzigingen toe door dubbel-bundel onderbrekingen van DNA te veroorzaken die fout-naar voren gebogen niet-homologe eind het toetreden of homologie-gerichte reparatie bij specifieke genomic plaatsen bevorderen.

afbeelding genomen van http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

de veelzijdigheid van Zfns en TALENs komt voort uit de mogelijkheid om het DNA-bindend domein aan te passen om vrijwel elke sequentie te herkennen. Deze DNA-bindende modules kunnen met talrijke effectordomeinen worden gecombineerd om genomic structuur en functie, met inbegrip van nucleases, transcriptional activators en repressors, recombinases, transposases, histone methyltransferases van DNA en histone acetyltransferases te beà nvloeden. Aldus, hangt de capaciteit om genetische veranderingen met succes uit te voeren grotendeels van de DNA-bindende specificiteit en affiniteit van ontworpen zink-vinger en VERHAALPROTEà nen af.

Cys2-His2 zinkvinger eiwitten

het cys2-his2 zinkvinger domein is een van de meest voorkomende soorten DNA-bindende motieven gevonden in eukaryoten en vertegenwoordigt het tweede meest gecodeerde eiwit domein in het menselijk genoom. Een individuele zinkvinger bestaat uit ongeveer 30 aminozuren in een geconserveerde ββα-configuratie. Verscheidene aminozuren op het oppervlak van de α-helix contacteren gewoonlijk drie basenparen in de belangrijkste groef van DNA, met variërende niveaus van selectiviteit. De modulaire structuur van zinkvinger-eiwitten heeft hen een aantrekkelijk kader gemaakt voor het ontwerp van aangepaste DNA-bindende eiwitten. De sleutel tot de toepassing van zink-vingerproteã nen voor specifieke DNA-erkenning was de ontwikkeling van onnatuurlijke reeksen die meer dan drie zink-vingerdomeinen bevatten. Deze vooruitgang werd vergemakkelijkt door de op structuur-gebaseerde ontdekking van een hoogst behouden linkeropeenvolging die bouw van synthetische zink-vingerproteã nen toeliet die de opeenvolgingen 9 tot 18 bps van DNA in lengte erkende. Omdat 18 bps van de opeenvolging van DNA specificiteit binnen 68 miljard bp van DNA kan verlenen, stond deze methode voor specifieke opeenvolgingen toe om in het menselijke genoom voor het eerst worden gericht.

Transcriptieactivator-achtige effecten

TALEs zijn van nature voorkomende eiwitten van het plantpathogene bacteriegeslacht Xanthomonas en bevatten DNA-bindende domeinen die bestaan uit een reeks van 33-35 aminozuurherhalingsdomeinen die elk een enkele bp herkennen. TALE specificiteit wordt bepaald door twee hypervariabele aminozuren die bekend staan als de repeat-variable diresidues (RVDs) . Als zink-vingers, worden de modulaire VERHAALHERHALINGEN met elkaar verbonden om aaneengesloten opeenvolgingen van DNA te erkennen. Nochtans in tegenstelling tot de proteã nen van de zinkvinger, was er geen re-engineering van de verbinding tussen herhalingen noodzakelijk om lange reeksen van verhalen met de capaciteit te construeren om theoretisch enige plaatsen in het genoom aan te pakken. Naast hun rol in het vergemakkelijken van HDR (homologe directe recombinatie), maken plaatsspecifieke nucleasen ook snelle generatie van cellijnen en organismen met nulfenotypen mogelijk; NHEJ-bemiddelde reparatie van een nuclease-veroorzaakte DSB leidt tot de introductie van kleine inserties of schrappingen bij de gerichte plaats, resulterend in knockout van genfunctie via kader-verschuiving veranderingen.

het CRISPR-systeem (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-associated (Cas) – systeem, dat losstaat van de hierboven beschreven locatiespecifieke nucleasen, is onlangs naar voren gekomen als een potentieel gemakkelijk en efficiënt alternatief voor ZFNs en TALENs voor het induceren van gerichte genetische veranderingen. In bacteriën, verstrekt het CRISPR systeem verworven immuniteit tegen het binnenvallen van vreemd DNA via RNA-geleide splitsing van DNA. In het type II CRISPR / Cas-systeem, worden de korte segmenten van buitenlands DNA, genoemd “afstandhouders” geïntegreerd binnen de genomic plaatsen CRISPR en getranscribeerd en in kort CRISPR RNA (crRNAs) verwerkt. Deze crRNAs ontharden aan trans-activerende crRNAs (tracrRNAs) en directe opeenvolgingsspecifieke splitsing en het tot zwijgen brengen van pathogeen DNA door CAS-proteã nen. Het recente werk heeft aangetoond dat de doelherkenning door de proteã ne Cas9 een “zaad” opeenvolging binnen de crRNA en een behouden dinucleotide-bevattende protospacer aangrenzende motif (PAM) opeenvolging stroomopwaarts van het crRNA – bindende gebied vereist. Het CRISPR / Cas-systeem kan daardoor opnieuw worden gericht om vrijwel om het even welke opeenvolging van DNA te splitsen door crRNA opnieuw te ontwerpen. Beduidend, is het systeem CRISPR/Cas getoond om direct aan menselijke cellen door medelevering van plasmiden te zijn die de Cas9 endonuclease en de noodzakelijke crRNA componenten uitdrukken.

afbeelding genomen van https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php