High Fidelity & Efficient PCR Enzyme: KOD DNA polymerase
the hyperthermophilic archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (voorheen Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) werd geïsoleerd uit een solfatarische hete bron (Fig. 2) op Kodakara island (Fig. 3) in Japan, en werd geïdentificeerd en gekarakteriseerd.
een familie B DNA-polymerase (KOD DNA-polymerase) werd gevonden in deze kod1-stam en vertoont verschillende unieke eigenschappen (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (Kodakara island, Japan))
-
Fig. 3. Kodakara island (prefectuur Kagoshima, Japan) )
de polymerase van KOD DNA vertoont sterke 3’→5′ exonuclease activiteit (proof-reading activiteit), een activiteit die de polymerase van Taq DNA mist.
bovendien vertoont dit enzym een uitstekende processiviteit en rek-vermogen, met een vijfvoudige hogere uitbreidingssnelheid (100-130 nucleotiden/seconde) en een 10-15-voudige hogere processiviteit (>300 basen) dan die van Pyrococcus furiosus (Pfu DNA-polymerase). De reksnelheid van dit enzym is ongeveer 2 keer hoger dan die van Taq DNA-polymerase (Tabel 1) (Fig. 4) (1).
Tabel 1. Eigenschappen van thermostable DNA polymerases
| Proterty | Waarde voor de aangegeven DNA-polymerase | ||
|---|---|---|---|
| KOD-DNA-polymerase | Pfu DNA-polymerase | Taq-DNA-polymerase | |
| Herkomst | Archaea | Archaea | Bacteriën |
| Afgeleid moleculaire massa (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| de Optimale temperatuur (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| Optimale pH op 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Thermostability (half-life) | 95ºC,12 h; 100oC,3.0 h | 95ºC, 6h; 100ºC, 2.9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Vergelijking van rek tarieven van KOD Pfu en Taq DNA polymerase.
de reksnelheid werd gemeten aan de hand van de lengte van gesynthetiseerd DNA, waarbij M13 ssDNA als sjabloon werd gebruikt bij 75ºC.
parallel met de studie van de activiteiten van de polymerase van KOD DNA, werden neutralisatieantilichamen voor de polymerase en het proeflezen activiteiten ontwikkeld (2). Deze antilichamen kunnen op de “hete technologie van beginpcr” worden toegepast gebruikend de polymerase van KOD DNA.
de 3-D structuur van DNA-polymerase werd in 2003 gekarakteriseerd (Fig. 5) (3).
Fig. 5. 3-D structuur van KOD DNA polymerase
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus- (Code nr. KOD-201) werd ontwikkeld gebaseerd op de polymerase van KOD DNA en stelt hoge PCR-getrouwheid (Table2) tentoon.
Tabel 2. Vergelijking van de mutatiefrequentie van elk PCR-enzym.
| Totaal bases Doorgeschoven | Aantal gemuteerde bases | Mutatie frequentie (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD -Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNA-polymerase | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-base lange-PCR-enzym | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA polymerase | 102,708 | 145 | 141.2 |
de betrouwbaarheid werd gemeten als de mutatiefrequentie door het PCR-product te sequencen. Na het klonen van het PCR-product (2,4 kb van het menselijke bèta-globinegebied), werden ongeveer 96 klonen geselecteerd en gesequenced.
KOD FX (Code nr. KFX-101) werd ontwikkeld gebaseerd op de polymerase van KOD DNA en toont een veel groter PCR-slagingspercentage (gebaseerd op efficiency en verlenging mogelijkheden) dan KOD-Plus – (Code nr. KOD-201) of andere op Taq gebaseerde PCR-enzymen. KOD FX is ook efficiënt voor versterking van ruwe specimens (b. v. muizenstaart lysate, gecultiveerde cellen).
Fig. 6. Directe amplificatie van een ruw muizenstaartlysaat
1,2: KOD FX
3 ~ 6: overige enzymen
M: Markers
