C. Polyacrylamide ingebed met fluorescerende parels
zoals beschreven in de vorige paragraaf, bleken siliciumsubstraten waardevol voor het meten van de krachten die worden uitgeoefend door snel bewegende keratocyten. Nochtans, zijn deze zelfde substraten veel minder nuttig voor het bestuderen van de meeste zoogdiercellen. Om de tracties nauwkeurig te berekenen, moet het substraat worden afgestemd op de motiliteit en krachtgeneratie van een bepaald celtype. Het is moeilijk om nauwkeurig een siliciumsubstraat van gewenste naleving te produceren voor trager bewegende cellen die hogere krachten kunnen uitoefenen. Om deze beperking te overwinnen, gebruikten Dembo en Wang (1999) een substraat van polyacrylamide dat met submicrometer-sized fluorescente parels wordt ingebed. De conformiteit van polyacrylamide substrata kan chemisch worden afgesteld door de monomeer-en crosslinkerconcentraties te variëren (Pelham and Wang, 1997). Polyacrylamide biedt een aantal extra voordelen ten opzichte van silicium substrata. Over een breed scala aan vervormingen vertoont het lineair elastisch gedrag. Ook polyacrylamide is meestal niet vatbaar voor celbinding op zichzelf, zonder de conjugatie van specifieke celadhesie liganden (Nelson et al., 2003). Daarom is het een perfecte steiger voor het bestuderen van celadhesie en gedrag op een controleerbare, gedefinieerde manier.
de rekenmethode waarbij vervormingen in het substraat worden gebruikt om de door de cel uitgeoefende tractie te bepalen, lijkt sterk op de methoden die worden gebruikt op bovengenoemde silicium-substraten met stress. Nochtans, heeft het gebruiken van fluorescente tellers de het volgen methode en de capaciteit zeer verbeterd om een nauwkeurig rekgebied te berekenen.
Dembo en Wang publiceerden verschillende studies met behulp van de resulterende techniek, tractiekrachtmicroscopie, die de mechanismen van fibroblastmigratie verheldert. In het bijzonder hebben zij aangetoond dat de lamellipodia van de cel bijna alle kracht leveren die nodig is voor voorwaartse beweging (Munevar et al., 2001a). Hun resultaten geven aan dat lamellipodium een mechanische entiteit is die verschilt van de rest van het cellichaam. Interessant, schijnt deze zelfde mechanische verdeling binnen de cel niet te bestaan in h-ras getransformeerde cellen, misschien het verschil in hun beweeglijk gedrag verklaren. Bovendien, Beningo et al. (2001) onderzocht de rol van brandpuntsadhesie in het reguleren van tractiegeneratie en vond dat de grootte van brandpuntsadhesie omgekeerd gerelateerd is aan de hoeveelheid geproduceerde kracht. Bovendien komt de verdeling van de verklevingen niet goed overeen met de verdeling van de trekkrachten. De auteurs concluderen dat deze resultaten erop kunnen wijzen dat vroege focale complexen verantwoordelijk zijn voor sterke stuwkrachten, en de rijping van deze adhesieplaatsen resulteert in een verandering in passieve ankerplaatsen — een conclusie die uitgebreid is besproken in de literatuur. Bovendien, Dembo en collega ‘ s onderzochten de dynamische rollen die voor-versus-achter adhesie (Munevar et al., 2001b), myosin IIb (Lo et al., 2004), focal adhesion kinase (Wang et al., 2001), en stretch-geactiveerde Ca2+ kanalen spelen in fibroblast migratie (Munevar et al., 2004). Gebruikend de microscopie van de tractiekracht, hebben Dembo en collega ‘ s significante vooruitgang in het begrijpen van de rol van krachtgeneratie in fibroblastmigratie geboekt.
een van de belangrijkste technische vooruitgang met polyacrylamidegel is het vermogen om de conformiteit van het cellulaire substraat op betrouwbare wijze te controleren zonder de ECM-dichtheid te veranderen. Het stemmen van de overeenstemming van het substraat was een kritisch keerpunt in de ontwikkeling van de microscopie van de tractiekracht, aangezien het voor het onderzoek van bijna om het even welk celtype en een begrip van celgedrag als functie van het mechanische milieu toestond. Voorafgaand aan de studie door Pelham en Wang (1997), concentreerde de meeste studies die celmigratie en adhesie onderzoeken zich op celmigratie in reactie op zijn oplosbare chemische milieu (chemotaxis) of in reactie op ligand geconjugeerd aan het substraat (haptotaxis). Bovendien, concentreerde de studies die het mechanische milieu van de cel impliceren zich op de reactie toe te schrijven aan opgelegde krachten zoals vloeibare afschuifspanning en mechanische rek. Nochtans, door de stijfheid van het substraat te veranderen, creëerden Pelham en Wang (1997) een significante verschuiving in de manier waarop onderzoekers cellulaire reactie en mechanotransductie benaderen. Met behulp van polyacrylamide substrata, Pelham en Wang hield de ECM-dichtheid op het substraat constant terwijl het veranderen van de mechanische naleving. Zij toonden aan dat fibroblasten in staat zijn om actief te reageren op de mechanische naleving van hun substraat. Cellen op stijvere gels zijn meer verspreid en migreren langzamer dan cellen op meer volgzame gels. Bovendien wordt de capaciteit van cellen om de mechanische naleving van hun substraat te voelen weerspiegeld in hun capaciteit om de phosphorylationstaat van talrijke proteã nen te veranderen die binnen de brandpuntsadhesiestructuur zijn vervat. De brandpuntsadhesie op stijve substraten is groter, langgerekt, en stabieler, terwijl de brandpuntsadhesie op volgzame substraten minder phosphorylated pp125fak en paxillin bevatten en onregelmatiger lijken. Deze resultaten waren de eerste om te suggereren dat mechanische ECM-signalen net zo belangrijk kunnen zijn als chemische signalen in het reguleren van celadhesie.
sinds het rudimentaire artikel van Pelham and Wang (1997) hebben een aantal studies de effecten van compliance op celgedrag onderzocht. Lo et al. (2000) gebruikt polyacrylamide chemie om een substraat met een stap in stijfheid te creëren — een centraal gebied van het substraat waar twee substraten van verschillende compliances elkaar ontmoeten. Zij toonden een gedrag genoemd durotaxis aan, waardoor de cellen actief veranderingen in de overeenstemming van het substraat konden ontdekken en Antwoorden. Cellen die op het zachte substraat migreerden, bij het raken van de grens van de stijf–zachte overgang, zouden op het stijve substraat overgaan, terwijl cellen op stijve substraten hogere tracties en meer verspreid gebied vertoonden, en of ingetrokken of richtingen veranderden in reactie op de stijf–zachte grens. Later, Wong et al. (2003) onderzocht het vermogen van fibroblasten om te migreren op polyacrylamide hydrogels die gradiënten van compliance bevatten, in plaats van een stap, zoals werd gedaan door Lo en collega ‘ s. Ze vonden dat vasculaire gladde spiercellen de neiging om sneller te migreren op zachtere substraten dan op stijvere substraten (15 kPa vs 25 kPa), en dat cellen de neiging om zich te accumuleren op stijvere substraten. Bovendien leek het migratiepatroon op gradiënt-conforme gels naar de stijvere gelregio ‘ s te worden gericht in plaats van het typische willekeurige looppatroon te vertonen dat kenmerkend is voor celmigratie. Engler et al. (2004) verder onderzocht celrespons op volgzame gels en toonde aan dat de reactie grotendeels door de assemblage van actin cytoskeleton wordt bemiddeld. Door veranderingen in het cytoskelet te testen, konden Engler en collega ‘ s aantonen dat de lichte overexpressie van actin in de cel voor het verlies van het verspreiden in zachte gelreacties kan compenseren. Bovendien, Yeung et al. (2005) toonde aan dat de gevoeligheidsdrempel voor compliance sensing celtype–specifiek is en dat cel-celcontacten ook kunnen helpen de morfologische veranderingen die in de zachte substraten worden gezien, te redden om nauwer te lijken op de morfologie van cellen op stijvere substraten (Yeung et al., 2005). Over het algemeen is de studie van durotaxis nog relatief jong, en er moet nog veel worden geleerd over hoe een cel mechanisch de materiële eigenschappen van zijn substraat en omgeving waarneemt en reageert.
