2.3.4.1 de structuur
het apo-sctla-4-homodimer werd uitgedrukt als een trombine-cleavable Fc-fusie-eiwit in CHO-cellen in aanwezigheid van kifunensine.23 na deglycosylering leverde het homodimer kristallen op die diffracteerden tot Bragg-afstanden van 1,8 Å, met eenheidscelafmetingen van A = 43,86 Å, b = 51,46 Å en c = 102,85 Å, en de ruimtegroep P212121 (Ref. 130). De structuur werd opgelost door moleculaire vervanging. De asymmetrische eenheid bestond uit een disulfide-gebonden homodimer die vergelijkingen mogelijk maakte met de sctla-4/sB7-1 en sCTLA-4/sB7-2 complexen, en met sCTLA-4 gebonden aan een gemanipuleerde lipocaline.131
de twee monomeren in de asymmetrische eenheid bestonden uit β-sandwich domeinen met AGFCC ‘ en ABED topologie zoals verwacht door Metzler et al.132 een kort acht-residu “stengel” disulfide-gebonden bij Cys122 verbond de igsf domeinen aan het membraan. Onverwacht leken de twee helften van de APO-CTLA-4 homodimer minder op elkaar dan op hun complexere tegenhangers, waarbij benadrukt werd dat binding niet gepaard gaat met grootschalige structurele herschikkingen (Fig. 2,2 H). Geautomatiseerde structuurvergelijkingen identificeerden CD28 en PD-1 als de structuren die het meest lijken op CTLA-4. Belangrijke verschillen tussen CTLA-4 en CD28 waren: (i) de aanwezigheid van een knik in β-streng G van CD28, (ii) veranderingen in de lusgrootte met inbegrip van uitgebreide AB -, BC-en CC’-lussen in CTLA-4 en een afgeknotte C”D-lus, en (iii) H-binding van de C’ – en c” β-strengen als gevolg van de herpositionering van de C ‘ – lus in CD28. Van groot belang was de grotendeels identieke bouw van de FG-lijn 99MYPPPY104-sequentie die de kern van hun ligand-bindende oppervlakken vormt. Slechts één enkel watermolecuul kon in het ongewoon droge ligand-bindende oppervlak van apo-CTLA-4 worden gevonden, terwijl 228 wateren elders werden ontdekt.
na CD28 en PD-1 waren de naast meest vergelijkbare structuren met het CTLA-4 V-set domein 215 antilichaam of TCR V-domeinen, meestal verschillend in luslengtes alleen. Het r. m. s. verschil voor superpositie van CTLA-4 met het meest vergelijkbare TCR Va domein was 2,09 Å voor 102 residuen, tegenover 2,89 Å voor 86 residuen voor de superpositie met D1 van CD2. Belangrijke gemeenschappelijke kenmerken met het Va-domein omvatten de lange CC ‘lus en behouden β-uitstulpingen in de C’ en G β-strengen die een uitgesproken draai op de agfcc’ β-sheet opleggen. Bijzonder opmerkelijk was de hoge mate van sequentiebehoud en ca-conformatie in de buurt van de G-streng β-bobbel, dat wil zeggen, GNGTQIYV (CTLA-4) en GDGTQLVV (Va). In CD2 en CTLA-4, de lussen waren vergelijkbaar, en de domeinen verschilden voor zover als: (i) in CD2 was er geen H-binding van de ßA-en ßB-strengen, (ii) was er geen twist van de A’ GFCC ‘β-plaat in CD2 als gevolg van herpositionering van de β-uitstulping, (iii) de positie van de C’ β-streng in CD2, maar niet CTLA-4 toegestaan canonieke H-binding en uitbreiding van de agfcc ‘ β-plaat, en (iv) CTLA-4 ontbrak de twist in de FG-lus aanwezig in CD2 (en ook, b.v. B7-1). De analyse van tweeënvijftig V-vastgestelde igsf domeinen gebruikend een opeenvolgend structuur alignment program133 wees erop dat de familie CD28/CTLA-4 een subgroep van V-vastgestelde domeinen omvat die van de groeperingen van CD8, antigeenreceptoren, en “adhesie” molecules, bijvoorbeeld, B7-1 en CD2 worden onderscheiden. In het algemeen was er een grotere overeenkomst tussen de CD28/CTLA-4-subgroep en de antigeenreceptorfamilie in vergelijking met de adhesieset. De analyse stelde voor dat CD28 / CTLA-4 familieproteã nen en antigeenreceptoren een gemeenschappelijke voorouder misschien gelijkend op PD-1, met de twee families die vroeg uiteenlopen deelden.
Apo-CTLA-4 bestond uit een homodimer met zijn subeenheden die een rangorde aannamen ten gunste van orthogonale bivalente interacties met liganden op apposerende celoppervlakken. Vergelijkingen met de CTLA-4 monomeerparen in de B7-1 en B7-2 complexen106,107 en het monomeer in de lipocaline complex131 onthulden zeer beperkte rotatieflexibiliteit op de homodimer interface en opmerkelijk weinig, indien van toepassing, veranderingen toe te schrijven aan ligandbinding. De enige verschillen waren duidelijk in het B7-2 complex, met lichte herpositionering van de BC en CC’ lussen, en van de C” β-streng en naburige lussen, en conformationele verschillen in de G β-streng op zijn c-Eindpunt. Deze lokale variaties stonden ver van de ligandbindingsplaats van CTLA-4 en in geen geval verschilden de apo-monomeren systematisch van alle vijf gecomplexeerde CTLA-4-monomeren. De hoofdketenatoomposities van de 99MYPPPY104-sequentie waren in wezen identiek.
de structuren van de complexen gevormd door CTLA-4 met B7-1 en B7-2, die niet eerder waren vergeleken, waren zeer verschillend.130 substitutie in B7-2, van Val28 Versus Arg29 in B7-1, vormde een bindend vak in B7-2 dat slechts gedeeltelijk door CTLA-4 werd ingevuld. Dit zorgde ervoor dat het B7-1/CTLA-4 complex een betere vormaanvulling vertoonde dan het B7-2/CTLA-4 complex. De oppervlakte die in B7-2 door CTLA-4 werd begraven, was iets groter dan die voor B7-1. In het algemeen, B7-1 gebonden CTLA-4 in een nog meer stijve lichaam-achtige manier dan CTLA-4 gebonden B7-1. B7-2 binding door CTLA-4 was echter complexer en droeg het kenmerk van ” induced fit.”In CTLA-4 gebonden-vs apo-B7–2, was er een 2.3-3.5 Å verschuiving van de B7-2 FG lus naar CTLA-4, die werd geïnitieerd door een ~ 120 graden rotatie van Phe31 van B7-2 (Ref. 130). Dit veroorzaakte een het stapelen interactie van Phe31 met Pro102 van de 99MYPPPY104 opeenvolging van CTLA-4.
