Kluyveromyces marxianus de ontwikkeling van ethanol tolerantie tijdens adaptieve evolutie met significante verbeteringen van meerdere trajecten

Betere weerstand te ethanol na een 100-dagen evolutie
DNA-analyse suggereert dat K. marxianus geen verandering van ploïdie of kritische genen heeft tijdens adaptieve evolutie
een globale herbedrading geïnduceerd door de 100-dagen evolutie
KM-100d verhoogd ethanolgebruik
KM-100d versterkt membraan lipide biosynthese, anti-osmotische druk, anti-oxidatieve stress en eiwitten vouwen te weerstaan ethanol stress
validatie van verhoogd ethanolverbruik en meervoudige stressbestendigheid in KM-100d

Betere weerstand te ethanol na een 100-dagen evolutie

Het wild-type haploïde K. marxianus stam werd gekweekt in medium met 6% (v/v) ethanol bij 30 °C gedurende 100 dagen ongeveer 450 generaties (zie Methoden voor details). Er was een continue toename van biomassa (gemeten door OD600 per dag) gedurende deze periode (Fig. 1a), die aangeeft dat de celoverleving onder ethanolspanning kan worden verbeterd. Uiteindelijk kregen we een K. marxianus populatie met sterk verbeterde weerstand tegen ethanol (Fig. 1 ter). KM – 100d verwijst naar de populatie K. marxianus na de evolutie van 100 dagen. De maximale ethanolbestendigheid voor KM was 7% (v/v) en voor KM-100d tot 10% (Fig. 1 ter). We vergeleken groeiprofielen tussen KM en KM-100d in kweekmedia met verschillende ethanolniveaus (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v/ v, Fig. 1c). Bij afwezigheid van ethanol was er geen significant verschil tussen de stammen. Hun verschil nam toe met de verhoging van het ethanolniveau en bereikte het maximum met 6% (v/v) ethanol in kweekmedia. In dergelijke omstandigheden was de biomassa van KM-100d na 48 uur bijna twee keer zo hoog als die van KM. Beide stammen toonden vertraagde groei in medium met 7% ethanol en faalden om in het medium met 8% ethanol te groeien. Bovendien vertoonde KM-100d ook een opmerkelijk hogere maximale groeisnelheid dan KM bij 6% ethanol (aanvullend dossier 1: Figuur S1).

DNA-analyse suggereert dat K. marxianus geen verandering van ploïdie of kritische genen heeft tijdens adaptieve evolutie

om DNA-veranderingen in KM-100d op te helderen, voerden we DNA-ploïdie-analyse en DNA-mutatie-identificatie uit. Tijdens de adaptieve evolutie heeft het DNA-gehalte van de K. marxianus populatie weinig verandering (aanvullend bestand 1: Figuur S2); er vond dus geen ploidy verandering plaats. Door DNA-seq-analyse van KM en KM-100d, die beide in kaart werden gebracht aan het referentiegenoom van K. marxianus dmku 3-1042, werden de SNP-plaatsen tussen KM en KM-100d verkregen (aanvullend dossier 2). Van de 57 SNP ‘ s waren er slechts 4 dominant in de populatie van KM-100d. Drie van hen worden gevestigd in het codagegebied van SAN1, YAP1, en KHT2 genen; de andere is bij 445 bp stroomopwaarts van ERG26. De 1324 plaats van SAN1 werd gemuteerd van C naar T, en bijgevolg werd het overeenkomstige aminozuur omgezet van arginine naar cysteïne. Echter, volgens de analyse van de Pfam 32.0, deze mutatie valt niet in een geïdentificeerd eiwit domein. Zowel de mutaties in YAP1 als KHT2 zijn synonieme mutaties zonder eiwitverandering. De bovenstaande bevindingen suggereren dat veranderingen in de context van DNA verre van voldoende zijn om een dergelijke fenotypische verbetering in KM-100d te ondersteunen, en transcriptionele herprogrammering moet hiertoe bijdragen. Daarom voerden wij verder RNA-seq analyse uit.

een globale herbedrading geïnduceerd door de 100-dagen evolutie

om de ethanoltolerantie goed te begrijpen, voerden we een RNA-seq-analyse uit om genexpressies van de KM-en KM-100d-gisten die in media groeiden te vergelijken met 4% en 6% (v/v) ethanol. Op basis van de groeiprofielen (Fig. 1c), werd waargenomen dat de groeicapaciteit tussen KM-100d en KM het maximumverschil bij 48 h had; vandaar, werden de steekproeven bij 48 h verzameld voor RNA-seq analyse. Instelling / log2ratio / ≥ 1 en p-waarde < 0.05 als criterium voor het definiëren van significante differentieel tot expressie gebrachte (DE) genen, voerden we de genidentificatie uit in zeven groepen (Fig. 2, aangeduid als 1, 2, 3, 4, 5, 6, en 7, respectievelijk). In elke groep werd de analyse uitgevoerd aan de hand van de pijl die naar de controle wees. Aanvullend bestand 3 biedt expressie waarden en differentiële expressie statistieken van alle genen. Er is een globaal expressieverschil tussen KM en KM-100d wanneer beide groeiden in een ethanol-vrij medium (Fig. 2 groep①). KM-100d-gisten hebben 1342 genen met een hogere expressie dan die van de KM-gist, terwijl slechts 188 genen een lagere expressie hebben. In media met 4% en 6% (v/v) ethanol, zijn de aantallen van up-gereguleerde genen in KM-100d sterk verminderd tot 415 (groep②) en 453 (groep③), respectievelijk. Nochtans, zijn de up-geregelde genaantallen nog veel meer dan die met lagere uitdrukking (104 en 182 genen, respectievelijk). Deze resultaten suggereren dat KM-100d gisten transcriptioneel opnieuw bedraad worden door een groot aantal genen te activeren. De suggestie werd verder ondersteund door de ethanol-geïnduceerde expressieveranderingen binnen de KM-en KM-100d-gisten. Onder inductie van 4% en 6% (v/v) ethanol, hebben de KM-gisten 1452 en 1465 up-gereguleerde genen (groepen ⑥ en⑦) terwijl de KM-100d-gisten respectievelijk 631 en 596 up-gereguleerde genen (groepen ④ en⑤) hebben. Daarnaast hebben we heatmap toegepast.2 software in R pakket aan cluster genen en groepen gebaseerd op log2ratio waarden (extra dossier 1: Figuur S3) en vond het gen differentiële expressieprofiel in Groep ① is dicht bij die van groep⑦. Samen, de KM-100d gisten behouden veel ethanol-geïnduceerde expressie kenmerken, zelfs als ze groeiden in een ethanol-vrij medium. De eigenschappen maken de geëvolueerde cel die meer adaptief aan up-coming ethanolstimulatie zijn, dwz KM-100d-gist hoeft niet zoveel genen te activeren als KM doet.

vervolgens hebben we in elke groep genontologie (GO) verrijkingsanalyse uitgevoerd voor de genen (aanvullend dossier 1: Figuur S4), en vond dat de verrijkte Go-termen een brede waaier van cellulaire basis fysiologische processen, met inbegrip van ribosoom biogenese, aminozuurbiosynthese, de reparatie van DNA, de verwerking van RNA, enz. omvatten., maar niet direct relevant voor ethanolweerstand. Daarom hebben we ons in het volgende bijzonder gericht op routes die sterk geassocieerd zijn met ethanolmetabolisme en tolerantie, door de geassocieerde de-genen te analyseren (aanvullend dossier 4).

KM-100d verhoogd ethanolgebruik

om grafische illustratie te vergemakkelijken, werden de log2ratiowaarden van betrokken genen (aanvullend dossier 4) onderverdeeld in vijf intervallen: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (en boven), zoals weergegeven in Fig. 3.

het verschil tussen KM en KM-100d in ethanolverbruik werd onderzocht. Zoals afgebeeld in Fig. 3, twee routes kunnen bestaan voor het direct consumeren van ethanol, en werden zowel up-geregeld in KM en KM-100d wanneer geconfronteerd met ethanol (groepen④,⑤,⑥, en⑦). Één manier is via cytoplasmic ADH6, die ethylalcohol aan acetaldehyde katalyseert, vergemakkelijkt door NADP+. De andere is door mitochondriale ATF1, die ethanolveresterificatie met behulp van acetyl-CoA bevordert. Vooral, in KM-100d onder ethanolspanning (groepen ④ en⑤), was YGL039W up-geregeld om meer NADP+ te produceren, en kan zo meer coenzymes voor het omzetten van ethanol in acetaldehyde leveren om ethanoltoxiciteit te verminderen. In mitochondriën, Voor KM blootgesteld in ethanolspanning (groepen ⑥ en⑦), waren alleen C2E1P301 en ADH4 up-gereguleerd. Terwijl in KM-100d, tijdens het proces van ethanol aan aldehyde aan acetaat, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4, en ALD6 allen up-geregeld waren (Groep①). De bovengenoemde veranderingen wijzen erop dat KM-100d nieuwe capaciteit zou kunnen verwerven om ethanoltoxiciteit te verlichten door ethylalcohol te verhogen consumeren. De theorie verklaart dat KM-100d over KM in medium met ethanol presteerde.

KM-100d versterkt membraan lipide biosynthese, anti-osmotische druk, anti-oxidatieve stress en eiwitten vouwen te weerstaan ethanol stress

Daarnaast wordt verbruikt, worden de cumulatieve ethanol is rechtstreeks van invloed op de cel membraan integriteit, verandert de innerlijke – en uiterlijke-osmotische druk , verstoort eiwit exterieur , en veroorzaakt het reactieve zuurstof species (ROS) generatie , waardoor ernstige schade aan de gistcel . In het volgende, analyseerden we de genen in deze routes voor anti-ethanol-veroorzaakte schade in K. marxianus (Fig. 4).

na ethanol-gedreven evolutie, werd de reactieweg van de alcoholspanning in KM-100d geactiveerd. ASR1, die translocates van het cytoplasma naar de kern van blootstelling aan ethanol , en ETP1, die fungeert als een cytoplasmatische retentie-eiwit een rol in ethanol-afhankelijke transcriptionele activatie van heat shock eiwitten genen , werden beide geregeld in KM-100d (Groep①), en deels gereguleerd in KM geconfronteerd ethanol (Groepen ⑥ en⑦), wat suggereert zelfs in een ethanol-gratis medium, KM-100d bereiden reageren trajecten voor ethanol uitdaging, net als de KM ‘ s antwoord op ethanol.

de vorming van membraanlipiden speelt een belangrijke rol bij het behoud van de integriteit van het celmembraan onder ethanolstress . Onverzadigde vetzuren, de belangrijkste componenten in de celmembraan structuur, zijn nauw verwant aan ethanoltolerantie . Geïllustreerd in Fig. 4, van acetyl-CoA aan onverzadigde vetzuurbiosynthese aan opname in phospholipid, waren de betrokken genen PPT2, FAD2, en TAZ1 allen up-geregeld in KM-100d (groep①), die voorstellen dat na evolutie, KM-100d reeds onverzadigde vetzuurbiosynthese kan verbeteren om meer grondstoffen voor biogenesis van het celmembraan te leveren. En de down-regulatie van genen ACC1, TSC13, FAS1 in KM blootgesteld in ethanol (groepen ⑥ en⑦), is in overeenstemming met het vorige rapport, dat kan verklaren voor K. marxianus’ zwakke ethanol tolerantie voor adaptieve evolutie.

een groot aantal genen geassocieerd met celmembraan lipide biogenese, waaronder fosfoglyceride, sphingolipide en sterol, werden differentieel uitgedrukt onder ethanolstress (Fig. 4). Vooral, genen betrokken bij phosphoglyceride biosynthese waren over het algemeen up-geregeld in KM-100d (groep①) en in km-onder ogen gezien ethanol (groepen ⑥ en⑦), die erop wijzen dat phosphoglyceride de belangrijkste component in celmembraan voor ethanolweerstand kan zijn. Voor sterol biosynthese, vele genen (b. v., ERG9 en ERG7) waren down-geregeld in groepen ④ en⑥, en verscheidene genen werden up-geregeld in Groep ⑤ (b.v., ERG25) en groep ⑦ (B. V., ERG26), die suggereren dat sterol biogenese belangrijk kan zijn voor het opstaan aan hoge ethanol, maar niet voor lage ethanol. Bovendien waren de genen CKI1, ERG2, en ERG25, betrokken bij phosphoglyceride en sterol biosynthese, slechts up-geregeld in groep⑤; dit kan één van de aanwijzingen voor de betere prestaties van KM-100d zijn dan KM in hoge ethylalcohol.

hoge ethanolconcentratie in een medium veroorzaakt osmotische stress op gistcellen . Zoals in Fig. 4, de plasma membraan van de osmotische sensoren (SLN1, OPY2, en SHO1) en genen (HOG1, SSK1, en SSK2) betrokken in de downstream-responsieve pad waren alle up-geregeld in KM blootgesteld in lage ethanol (Groep⑥), en individueel up-geregeld in KM-100d (Groep①), in KM-100d geconfronteerd ethanol (Groepen ④ en⑤), en in KM geconfronteerd met hoge ethanol (Groep⑦). De glycerolproductie is een belangrijke manier voor S. cerevisiae die zich tegen osmotische druk verzet . Toen KM en KM-100d ethanol onder ogen zagen, waren de meeste genen met betrekking tot glycerol biogenese down-gereguleerd. De bovenstaande bevindingen suggereren dat Voor en na de evolutie, K. marxianus verbetert altijd wegen voor het ontdekken en omzetten van osmotische spanningssignalen; nochtans, kan zijn strategie om zich tegen osmotische spanning te verzetten zich niet op de glycerolproductieroute baseren, moet er een andere manieren bestaan.

celwand biedt voldoende mechanische sterkte voor de cel om osmotische druk te weerstaan , en de secretorische route transporteert niet alleen celwandeiwitten naar buiten, maar brengt ook lipiden over op het plasmamembraan om de membraanstructuur te versterken; daarom kunnen deze twee processen verantwoordelijk zijn voor anti-osmotische stress. We analyseerden de genen in de secretoire pathway en celwand biogenese (aanvullend bestand 1: Figuur S5). De genen betrokken bij de secretoire weg en de biogenese van de celwand werden over het algemeen up-geregeld in KM-100d (groep①), en sommigen van hen werden ook up-geregeld in km blootgesteld in ethanol (groepen ⑥ en⑦). Het impliceert dat KM-100d niet alleen de up-regulatie in secretoire weg handhaafde Voor KM bestand tegen ethanolspanning, maar ook wijd het activeringsbereik van secretoire weg uitbreidde om zich voor te bereiden op ethanolaanval; vandaar, kan de verhoging van secretoire weg en de vorming van de celwand de nieuwe strategie KM-100d zijn die wordt ontwikkeld om ethylalcohol-veroorzaakte osmotische spanning te verduren. Aan de andere kant, voor KM en KM-100d blootgesteld in lage ethanol (groepen ④ en⑥), veel genen in de secretoire pathway waren beide down-gereguleerd, wat suggereert dat secretoire pathway activering misschien niet de noodzakelijke manier voor K. marxianus reageren op lage ethanol.

voor tegen oxidatieve stress veroorzaakt door ethanol (Fig. 4), HYR1 , die als sensor en transducer van hydroperoxide spanning functioneert, was up-geregeld in KM en KM-100d beide blootgesteld in hoge ethanol (groepen ⑤and⑦). Oxidatieve stress-responsieve transcriptiefactoren SKN7 en STB5 werden up-gereguleerd in KM-100d (groep①) en in KM geconfronteerd met hoge ethanol (Groep⑦). Voor anti-oxidatieve stress, genen betrokken bij het superoxide dismutase systeem (bijvoorbeeld MTM1 en PRX1) waren over het algemeen up-gereguleerd in KM-100d ofwel blootgesteld in ethanol of niet (groepen①, ④ en⑤). Voor het thioredoxinesysteem zijn genen (bijv., MXR1 en TRR1) waren up-gereguleerd in KM en KM-100d beide geconfronteerd ethanol. Van thioredoxine en zijn reductase werd ook gemeld dat het de tolerantie van K. marxianus voor van lignocellulose afgeleide remmers verhoogt . Voor het glutaredoxinesysteem waren de genen GRX2 en GLR1 alleen up-gereguleerd in KM-100d blootgesteld in hoge ethanol (Groep⑤). Voor peroxisome biogenese, genen zoals PEX6 en PEX7 werden up-geregeld in KM-100d (groep①), en sommige andere genen (b.v., PEX3 en INP2) werden down-geregeld in KM en KM-100d wanneer geconfronteerd met lage ethanol (groepen ④ en⑥). Het bovenstaande impliceert dat KM-100d wereldwijd anti-oxidatie vermogen kan versterken.

om te zorgen voor een goede eiwitvouwing onder ethanolspanning (Fig. 4), het heat shock transcriptie factor HSF1 is up-geregeld in KM en KM-100d geconfronteerd lage ethanol (Groepen ④ en⑥), een aantal van chaperonne-gerelateerde genen (bijv. PFD1 en CPR7) hadden geregeld in KM geconfronteerd ethanol (Groepen ⑥ en⑦), ook up-verordening in KM-100d (Groep①). Sommige genen (b.v. CPR4) down-gereguleerd in km geconfronteerd ethanol waren niet down-gereguleerd in KM-100d. Daarom kunnen KM-100d over het algemeen eiwit het vouwen verbeteren om een stabieler cellulair milieu te verstrekken.

in S. cerevisiae werd gemeld dat trehalose-accumulatie belangrijk was voor de ethanoltolerantie, omdat trehalose werkte als compatibele opgeloste stof om de instroom van overtollige zouten in gistcellen te voorkomen ; ondertussen werden ook genen die betrokken zijn bij trehalose-afbraak geïnduceerd door ethanol, om dit bij de optimale concentratie aan te passen . Voor K. marxianus (Fig. 4), vonden we dat genen die deelnemen aan trehalose biosynthese en degradatie (bijv., NTH1 en TSL1) werden gewoonlijk up-gereguleerd wanneer behandeld met lage ethanol (groepen ④ en⑥), maar niet gen up-gereguleerd in trehalose metabolisme wanneer blootgesteld in hoge ethanol (groepen ⑤ en⑦). Dit suggereert dat in K. marxianus, trehalose accumulatie een speciale strategie kan zijn voor het omgaan met lage ethanol, maar niet voor hoge ethanol.

de differentiële expressies van 15 genen die betrokken zijn bij de bovengenoemde ethanoltolerante routes werden gevalideerd met RT-qPCR-analyse (Fig. 5). De uitdrukkingen van genen in Groep ① (Fig . 5a) waren over het algemeen up-gereguleerd. Aan de andere kant, de up-regulatie van genen in Groep ④ (Fig. 5d) en groep ⑤ (vijg. 5e) was niet zo hoog als in Groep ⑥ (Fig. 5b) en groep ⑦ (Fig. 5c). Onze Analyse bevestigde dat genen die bijdragen aan ethanoltolerantie continu worden geactiveerd in KM-100d, zelfs na het terugtrekken van ethanolstress. De ononderbroken genuitdrukking zou nuttig kunnen zijn om het intracellular milieu te stabiliseren en aan de groei van cellen in aankomende spanning te profiteren.

validatie van verhoogd ethanolverbruik en meervoudige stressbestendigheid in KM-100d

we controleerden de groei van KM-en KM-100d gisten in YNB-medium met verschillende koolstofbronnen (Fig. 6 bis). Zowel de KM als De KM-100d gisten hebben hetzelfde vermogen om glucose te gebruiken als de enige koolstofbron. In de aanwezigheid van 1% en 2% (v/v) ethanol als enige koolstofbron groeiden KM-100d-gisten echter beter dan KM-gisten. Het resultaat ondersteunt onze eerder genoemde hypothese dat de KM-100d-gisten ethanol efficiënter gebruikten dan de KM-gisten.

aan de andere kant, gebaseerd op Fig. 4, KM-100d kunnen weerstand tegen ethanol-veroorzaakte veelvoudige spanningen gelijktijdig ontwikkelen, met inbegrip van osmotische spanning, oxidatieve spanning, en thermische spanning (voor de proteã nen van de hitteschok die als chaperones voor eiwit vouwen worden genomen). Om de toleranties van de gisten op meerdere spanningen te evalueren, hebben we de cellevensvatbaarheidsanalyse uitgevoerd voor verschillende temperatuur -, oxidatie-en osmotische druk (Fig. 6b-d). In de basisomstandigheden (d.w.z. 30 °C, 0% H2O2 en 0 M NaCl) ontbreekt een verschil in levensvatbaarheid tussen de gisten KM en KM-100d. In de aanwezigheid van de verschillende spanningen vertonen KM-100d-gisten echter een aanzienlijk betere levensvatbaarheid dan die van de KM-gisten. Verder zijn de voordelen groter, terwijl de spanningen ernstiger werden (Fig. 6b-d). We verwachtten dat de toleranties op meerdere spanningen nieuwe eigenschappen zouden kunnen introduceren aan de gisten in de ethanolproductie.

we hebben verder onderzoek gedaan naar de ethanolproductiviteit tussen de KM-en KM-100d-gisten onder meervoudige belasting. In basisomstandigheden (30 °C en 0% ethanol, Fig. 6e), de KM en KM-100d gisten zijn bijna hetzelfde in zowel glucose consumptie en ethanol productie. Bij hoge temperaturen (45 °C, Fig. 6f) of meer ethanol (6% of 8%, Fig. 6g, h); de gemeenschappelijke omgeving gebeurde meestal in het late stadium van de fermentatie. We hebben een RT-qPCR-analyse uitgevoerd voor zowel KM-Als KM-100d-gisten gefermenteerd in media met 6% ethanol bij 48 uur, 72 uur en 120 uur (Fig. 7). De meeste van deze ethanol-tolerante genen werden up-geregeld in KM-100d vergeleken met In KM, vooral in het vroege stadium (48 h) voor de eerste aanpassing aan ethanol (Fig. 7). Om samen te vatten, door up-regulerende uitdrukkingen van ethanol-tolerante genen, De KM-100d gisten overtroffen de KM-gisten onder stressvolle omgevingen met verhoogde ethanolopbrengst.