1. Kras-mutatietest exon 2 (codons 12/13) en exon 3 (codon 61): Cobas® KRAS-Mutatietest voor In-vitrodiagnostiek (Roche).
de cobas ® KRAS-Mutatietest is een real-time PCR-test voor de kwalitatieve detectie van somatische mutaties in exon 2 (codons 12/13) en exon 3 (codon 61) van het Kras-gen met behulp van een DNA-input van 100 ng. De test kan 19 kras mutaties detecteren. De aanwezigheid van mutaties wordt gedetecteerd met een analytische specificiteit van ten minste 99% en een detectielimiet van ten minste 5% mutantniveau in een achtergrond van wild-type genomisch DNA.
de cobas ® KRAS-Mutatietest is gebaseerd op twee belangrijke processen: (1) handmatige monstervoorbereiding om genomisch DNA te verkrijgen uit één of twee 5 µm dikke delen van FFPE CRC-weefsel dat ten minste 10% tumorcellen bevat; (2) PCR-amplificatie van doel-DNA met behulp van complementaire primerparen en twee oligonucleotide-sondes die met fluorescerende kleurstof zijn gelabeld. De gebruikte primerparen definiëren een 85-basenpaarsequentie voor exon 2 met KRAS-codons 12 en 13, en een 75-basenpaarsequentie voor exon 3 met KRAS-codon 61 in menselijk genomisch DNA. Een sonde is ontworpen om de kras codon 12/13 sequentie in exon 2 te detecteren, en de andere sonde is ontworpen om de kras codon 61 sequentie in exon 3 van het Kras gen te detecteren. Mutatiedetectie wordt bereikt door smelting curve analyse door de cobas z 480 analyzer (1).
2. KRAS-Mutatietest v2 (LSR)
de KRAS-Mutatietest v2 (LSR) is een allel-specifieke, real-time PCR-test voor de kwalitatieve detectie en identificatie van exon 2, 3 en 4 mutaties in het v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoom viraal oncogeen homolog (KRAS) gen uit formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed Weefsel (FFPET). De test is ontworpen om 28 unieke mutaties op te sporen. De aanwezigheid van mutaties wordt gedetecteerd met een analytische specificiteit van ten minste 99% en een detectielimiet van ten minste 1% mutantniveau in een achtergrond van wild-type genomisch DNA.
de KRAS-Mutatietest v2 (LSR) is gebaseerd op twee processen: (1) handmatige monstervoorbereiding om genomisch DNA uit FFPET te verkrijgen; en (2) PCR-versterking en detectie van doel-DNA met behulp van complementaire primerparen en oligonucleotide-sondes gelabeld met fluorescerende kleurstoffen.
de KRAS-Mutatietest v2 (LSR) maakt gebruik van primers die specifieke basenpaarsequenties definiëren voor elk van de beoogde mutaties. Amplificatie vindt alleen plaats in de regio ‘ s van het Kras-gen tussen de primers; het hele gen wordt niet versterkt. De kras-sequenties variëren van 79 tot 114 basenparen. Mutatiedetectie wordt bereikt door PCR-analyse met de cobas z 480 analyzer. (1)
3. BRAF/NRI ’s Mutation Test (LSR)
De BRAF/NRI’ s Mutation Test (LSR) is een allel-specifieke real-time PCR test voor de kwalitatieve detectie en identificatie van exon 11 en 15 mutaties in proto-oncogen B-Raf (BRAF gen en exon 2, 3, en 4 mutaties in het neuroblastoom RAS virale oncogen homologe (NRI ‘ s) gen van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebed weefsel (FFPET).
de test is ontworpen om 36 unieke mutaties op te sporen. De aanwezigheid van mutaties wordt gedetecteerd met een analytische specificiteit van ten minste 99% en een detectielimiet van ten minste 5% mutantniveau in een achtergrond van wild-type genomisch DNA.
de BRAF / NRAS-Mutatietest (LSR) is gebaseerd op twee belangrijke processen: (1) handmatige monstervoorbereiding om genomisch DNA uit FFPET te verkrijgen; en (2) PCR-versterking en detectie van doel-DNA met behulp van complementaire primerparen en oligonucleotide-sondes gelabeld met fluorescerende kleurstoffen.
de BRAF / NRAS-Mutatietest (LSR) maakt gebruik van primers die specifieke basepaarsequenties definiëren voor elk van de beoogde mutaties. Amplificatie vindt alleen plaats in de gebieden van de BRAF-of NRAS-genen tussen de primers; het hele gen wordt niet versterkt. BRAF-sequenties variëren van 101-120 basenparen. NRAS-sequenties variëren van 94-121 basenparen. Mutatiedetectie wordt bereikt door PCR-analyse met de cobas z 480 analyzer. (2)
klinische implicatie
KRAS en NRI ‘ s zijn nauw verwante RAS-oncogenenfamilies, en mutaties in beide gen op codons 12, 13 (exon 2), codon 61 (exon 3) en codon 146 (exon 4) resulteren in verhoogde niveaus van aan guanosine trifosfaat gebonden RAS-eiwitten. Het overactieve RAS signaleren bevordert oncogenese. In colorectaal carcinoom (CRC), KRAS en NRAS mutaties op deze codons worden gevonden in Maximaal 50% van de gevallen en voorspellen een gebrek aan respons op anti-EGFR therapie. De meeste RAS-mutaties zijn puntmutaties die voorkomen in kras exon 2 (codons 12 of 13; ongeveer 40%). Andere RAS-mutatie komt minder vaak voor, waarbij de meest voorkomende mutaties voorkomen in kras exons 3 en 4 en NRI ‘ s exons 2 en 3 (3).
ongeveer 50% van de melanomen hebben activerende mutaties in BRAF. Meer dan 90% van de BRAF-mutaties resulteert in een nucleotide 1799 T>, een verandering die leidt tot een valine-op-glutaminezuur-substitutie op positie 600 (V600E). De mutatie BRAF V600E veroorzaakt ongecontroleerde signalering van de MAPK-route die leidt tot overmatige celgroei en proliferatie. Middelen gericht op geactiveerde mutant BRAF (BRAF-remmers) zijn succesvol gebleken bij patiënten met gemetastaseerd melanoom dat deze mutatie herbergt (1-3).
naast de voorspellende waarde bij melanoom heeft de BRAF V600E-mutatie ook prognostische waarde bij colorectale kanker en bij longkanker (NSCLC) (4,5,7). De BRAF V600E-mutatie wordt aangetroffen bij ongeveer 10% van het gemetastaseerde colorectale carcinoom en is geassocieerd met de aanwezigheid van instabiliteit van microsatelliet (6). In het algemeen hebben patiënten met BRAF-mutant CRC lage responspercentages op conventionele therapieën en een ongunstige prognose. Hoewel BRAF V600-gemuteerde melanomen gevoelig zijn voor BRAF-remmers, is het mogelijk dat BRAF V600-gemuteerde CRC ‘ s minder gevoelig zijn. Activering van EGFR bij colorectale kanker kan verklaren waarom colorectale kanker over het algemeen een lagere respons heeft op BRAF-remmers. Daarom wordt geadviseerd een combinatietherapie met EGFR – en BRAF-remmers te starten.
de BRAF V600E-mutatie wordt ook aangetroffen bij 3-5% van alle longkanker (7). Hoewel BRAF-remmers succesvol zijn gebleken bij V600E-mutatiepositieve NSCLC – patiënten, heeft de FDA het gebruik van de combinatietherapie met BRAF-en MEK-remmer goedgekeurd voor NSCLC-patiënten met een V600E-mutatie op basis van de resultaten van een internationaal, multicenter, drie-cohort, niet-gerandomiseerd, niet-vergelijkend, open-label onderzoek bij patiënten met lokaal bevestigde BRAF V600E-mutatiepositieve gemetastaseerde NSCLC.
vereiste monsters
aanvaardbare monsters voor de bepaling zijn weefselmonsters met een fixatietijd van 6-48 uur met formaline gefixeerd, paraffinegeïntegreerd colorectaalcarcinoom.
Volume
1 representatief paraffineblok verdient de voorkeur. Als alternatief is voor resectiemonsters een minimum van 5 niet-beklede weefselsecties (5 µm dik) vereist (volledige RAS-test).
opslag-en transportinstructies
specimens op omgevingstemperatuur houden en verzenden.
beperkingen
onvoldoende tumorgehalte maakt mogelijk de detectie van kras/NRI ‘ s/BRAF-mutaties niet mogelijk: 10% van de tumorcellen is vereist. Tumorinhoud wordt voorafgaand aan analyse geëvalueerd en macrodissectie wordt uitgevoerd. Andere fixeermiddelen dan formaline of verlengde fixatietijd kunnen tot onvoldoende resultaten leiden.
bijzondere vereisten
geen.
Turn-around-time
5 tot 7 werkdagen voor respectievelijk objectglaasjes en paraffineblokken.
- Li et al. Een zeer geverifieerde test voor KRAS mutatie detectie in weefsel en Plasma van Long -, colorectale en pancreaskanker. Arch Pathol Lab Med. 2019 Feb;143:183-9
- Patton et al. Een gevoelige en nauwkeurige test voor gelijktijdige detectie van 36 BRAF-en NRAS-mutaties. Tijdschrift voor Klinische Oncologie 2018 36:15
- Douillard JY et al. Behandeling met Panitumumab-FOLFOX4 en RAS-mutaties bij colorectale kanker. N Engl J Med. 2013 Sep 12; 369 (11): 1023-34.
bijgewerkt op 03 December 2019
