Kruppel-achtige factor 2 (KLF2) reguleert pro-inflammatoire activatie van monocyten

resultaten

KLF2-expressie wordt verminderd met Monocyte activatie/differentiatie in macrofagen.

om de rol van KLF2 in de regulatie van immuuncellen zoals monocyt/macrofaag beter te begrijpen, hebben we eerst de expressie van KLF2 in primaire humane monocyten geëvalueerd. Zoals in Fig. 1 Een links, klf2 uitdrukking is robuust in primaire menselijke monocytes en sterk verminderd met differentiatie in macrofagen na 5 dagen. KLF2 uitdrukking in de menselijke monocytic cellijn THP-1 was veel lager dan die in primaire menselijke monocytes. Nochtans, werd de uitdrukking verder verminderd bij behandeling van deze cellen met LPS of 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetaat, twee agenten goed gevestigd om cellulaire activering of differentiatie te induceren (Fig. 1 A Rechts).

vervolgens probeerden we te bepalen of KLF2 expressie wordt gereguleerd in de inflammatoire setting in vivo. Monocytaire activering is een belangrijke pathofysiologische gebeurtenis in de ontwikkeling van atherosclerose, een chronische low-grade inflammatoire aandoening, dus we redeneerden dat KLF2 expressie kan worden verminderd bij deze patiënten (11). We onderzochten een groep van 14 leeftijd-matched normale proefpersonen en 14 patiënten met uitgebreide atherosclerose (≈50% met voorgeschiedenis van coronaire revascularisatie) die zijn gestratificeerd door de laagste en hoogste niveaus van Finkel–Biskis–Jinkins osteosarcoom gen (FOS), respectievelijk, die is aangetoond te dienen als een marker van ontsteking (12). Zoals in Fig. 1 B, KLF2 expressie was significant verminderd met ≈30% bij patiënten. Er werd daarentegen geen significant effect waargenomen voor KLF3, KLF6, KLF11 en KLF13. In overeenstemming met onze vorige studie was de FOS-expressie significant verhoogd bij patiënten met coronaire hartziekte (12).

KLF2 remt Monocyte activatie en fagocytische capaciteit.

als reactie op inflammatoire stimuli drukken monocyten verhoogde niveaus van pro-inflammatoire factoren en cytokines/chemokines uit en vertonen ze een verhoogde fagocytaire capaciteit. Om inzicht te krijgen in de rol van KLF2 in monocyte-functie, ondernamen we overexpressiestudies. THP-1 cellen werden geïnfecteerd met of controle leeg virus (EV) of KLF2 (Ad-KLF2) voor 24-48 h en dan gestimuleerd met LPS voor 2 en 6 h. zoals getoond in Fig. 2 A, behandeling van EV-geïnfecteerde cellen met LPS (25 ng/ml) resulteerde in een robuuste inductie van cyclo-oxygenase (COX)-2, weefselfactor en monocyt chemoattractant proteïne (MCP)-1 mRNA. Deze inductie werd daarentegen duidelijk afgezwakt in met KLF2 geïnfecteerde cellen (Fig. 2 A). Vergelijkbare effecten werden ook waargenomen in de muizenmonocyt-cellijn J774a (gegevens niet getoond). Bovendien remde overexpressie van KLF2 sterk de secretie van verschillende cytokines en chemokines. Zoals in Fig. 2 B, KLF2-overexpressie verzwakte de LPS-gemedieerde inductie van factoren zoals CD40L (met 49,6%), macrofaag ontstekingseiwit 1α (48,4%), macrofaag ontstekingseiwit 1β (64,2%), IL-1β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) en MCP-1 (68,8%). Dit effect was specifiek omdat er geen significant effect werd waargenomen op de niveaus van meerdere andere relevante groeifactoren (tgfß1, van bloedplaatjes afgeleide groeifactor en granulocyt/macrofaagkoloniestimulerende factor), cytokines/chemokines (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1α en IFN-γ) of matrixveranderende enzymen (matrixmetalloproteïnase types 1, 2, 3 en 9) (gegevens niet getoond).

een klassiek kenmerk van de geactiveerde monocyte/macrofaag is fagocytose. Om te bepalen of KLF2-overexpressie het fagocytisch vermogen van monocyten beïnvloedt, overexpresseerden we KLF2 of controle (EV) in THP-1-cellen, gestimuleerd met LPS, en beoordeelden we het vermogen van deze cellen om Texas rood-gelabelde zymosan a bioparticles op te nemen. Zoals in Fig. 2 C, controle virus-geïnfecteerde cellen opgenomen de zymosan bioparticles. Daarentegen was de opname door KLF2-expressieve monocyten aanzienlijk verminderd (Fig. 2 C). Samen genomen, tonen deze gegevens aan dat KLF2 monocyte afscheiding van cytokines/chemokines en fagocytose kan remmen.

KLF2 remt de rekrutering van monocyten niet.Vervolgens probeerden we het effect van KLF2 op de monocyt-functie in vivo te beoordelen. Als reactie op een verwonding of een ontstekingsstimulus worden monocyten uit de bloedbaan naar weefsels gerekruteerd. We eerst ondernam studies om te beoordelen of monocyte werving werd gewijzigd door klf2 expressie. Om de bijdrage van andere celtypes te minimaliseren gebruikten we C. B-17-Scid-beige muizen die deficiënt zijn in t, B, en natural killer cellen. Deze dieren (n = 5 per groep) werden vervolgens aan totale lichaamsbestraling onderworpen en gereconstitueerd met J774a-cellen die adenoviraal waren geïnfecteerd met controlevirus (EV) of KLF2 door middel van injectie van de staartader (beschreven in materialen en methoden). Dieren werden vervolgens onderworpen aan i. p. injectie van thioglycolaat (een krachtige chemische irriterende stof die monocyten rekrutering induceert), en het aantal GFP-positieve cellen werd 48 uur later beoordeeld door stroom cytometrische analyse. Zoals in Fig. 2 C en D, klf2 remde niet de rekrutering van GFP + J774a monocytes aan de buikholte. Inderdaad, merkten wij reproduceerbaar op dat KLF2-transduced dieren een significante verhoging van GFP + cellen tentoonstelden. Deze gegevens suggereren dat KLF2 niet remt maar eerder verhoogt monocytaire rekrutering aan een inflammatoire plaats.

KLF2 remt door carrageen geïnduceerde ontsteking.

na rekrutering en migratie in weefsels scheiden monocyten cytokines, chemokines en groeifactoren af om de inflammatoire respons te bestendigen. Zoals in Fig. 2 B, merkten we op dat KLF2 overexpressie de uitwerking van verschillende cytokines en chemokines verzwakte. Om te bepalen of KLF2 invloed heeft op de monocytaire pro-inflammatoire functie, hebben we gebruik gemaakt van een bekend model voor ontsteking: carrageen-geïnduceerde voetpad injectie. Injectie van deze chemische stof is eerder aangetoond dat reproduceerbaar induceren een ontstekingsreactie gekenmerkt door pootoedeem (13-15). C. B-17-Scid-beige muizen (n = 4 per groep) werden bestraald zoals hierboven beschreven, gereconstitueerd met controle-of KLF2-expressie j774a-cellen, en vervolgens uitgedaagd met carrageen-injectie in het voetpad (beschreven in materialen en methoden). Pootvolume werd bepaald met behulp van een hydroplethismometer aangepast voor kleine volumes (Ugo Basile, Milaan). Zoals in Fig. 2 met F, EV geïnfecteerde dieren vertoonden een toename van 17 ± 1,08-mm3 en 23,3 ± 3,05-mm3 in pootvolume na respectievelijk 1 en 2 uur carrageen-injectie. Daarentegen vertoonden de dieren die werden gereconstitueerd met KLF2-expressie j774a-cellen slechts een toename van respectievelijk 6,25 ± 0,85-mm3 en 7,5 ± 0,95-mm3 in het pootvolume op 1 en 2 uur na de carrageen-injectie (Fig. 2 F). In overeenstemming met dit Grove effect, histologische analyse van de poten bleek verminderde vloeistof extravasatie, wat leidt tot oedeem vorming (Fig. 2 G, pijlen).

Effect van Klf2 Knockdown op Ontstekingsgenexpressie.

om het belang van KLF2 in monocytaire ontstekingsgenexpressie te bepalen, werden ook kleine interfererende RNA (siRNA)-gemedieerde knockdown-onderzoeken uitgevoerd. Zoals in Fig. 2 uur, in vergelijking met onbehandelde (controle) en niet-specifieke met siRNA behandelde cellen, resulteerde neerhalen van KLF2 (≈60% neerhalen) in J774a cellen in een inductie van ontstekingsgenen zoals MCP-1 en een meer bescheiden effect op COX-2 en weefselfactorexpressie niveaus. Deze resultaten werden ook geverifieerd met real-time PCR-analyse (Fig. 2 I).

KLF2 remt de NF-kB-en Ap-1-Promotoractiviteiten.

KLF2 kan de LPS-gemedieerde inductie van MCP-1, COX-2 en weefselfactor krachtig remmen (Fig. 2 A). Het is bekend dat de inductie van deze targets door pro-inflammatoire stimuli wordt gereguleerd door transcriptionele routes zoals NF-kB en AP-1. Wij redeneerden dat, in principe, KLF2 deze routes op meerdere niveaus zoals expressie, DNA-binding, of inductie van transcriptionele activiteit kan remmen.

we richtten ons eerst op NF-kB gezien zijn centrale rol bij ontstekingen. Overexpressie van KLF2 veranderde de nucleaire accumulatie van p65 niet of de nucleaire niveaus van IKB-kinase (IKK) α en IKKy (Fig. 3 A). Bovendien veranderde KLF2-overexpressie niet de kinetiek van IKB-fosforylering of-afbraak of cytoplasmatische niveaus van IKKa, IKKß en IKKy (Fig. 3 B). In overeenstemming met deze waarnemingen had KLF2 geen invloed op de NF-kB binding aan DNA. Zoals in Fig. 3 C, behandeling van met het controlevirus geïnfecteerde cellen (EV) met LPS veroorzaakte een enkele belangrijke band. Uit concurrentie-en supershiftstudies is gebleken dat deze band NF-κΒ vertegenwoordigt. Een bijna identiek patroon van NF-kB binding werd waargenomen in KLF2-overexpressie cellen. Om te beoordelen of KLF2 NF-kB-gemedieerde transcriptionele activering kan beà nvloeden, werden gen-verslaggeversanalyses uitgevoerd. Zoals in Fig. 3 D, transfectie van p65 met een NF-kB luciferase reporter plasmide induceerde transcriptionele activiteit met ≈11-voudig. Deze inductie was sterk verminderd in aanwezigheid van KLF2, wat erop wijst dat KLF2 de NF-kB transcriptionele activiteit remt. Vergelijkbare effecten van KLF2 werden waargenomen voor de AP-1-Route (Fig. 5 A-C, die als ondersteunende informatie op de PNAS-website wordt gepubliceerd).

rekrutering van de COACTIVATOR CBP-Associated Factor (PCAF) door KLF2 als een verenigend mechanisme.

samen zijn de resultaten in Fig. 3 geeft aan dat KLF2 NF-kB-gemedieerde transactivatie kan remmen onafhankelijk van effecten op de DNA-binding van deze factoren. Een mogelijk mechanisme is de rekrutering van kritische coactivatoren. Bijvoorbeeld, vereist de optimale NF-kB band interactie met verscheidene belangrijke coactivators zoals steroid receptor coactivator (SRC)-1, PCAF, en P300/CBP. KLF2 kan interageren met één of meer van deze factoren, hen uit de buurt van NF-kB rekruteren, en, als gevolg daarvan, NF-kB-gemedieerde transcriptionele activiteit verminderen.

om de rol van PCAF in KLF2-gemedieerde remming van NF-kB transcriptionele activiteit te bepalen, hebben we cotransfectiestudies uitgevoerd met exogene PCAF. Transfectie van PCAF (maar niet p300; gegevens niet getoond) aanzienlijk gered de KLF2-gemedieerde onderdrukking van de NF-kB concatemer (Fig. 4 A). Een gedeeltelijke redding werd ook waargenomen op het vermogen van KLF2 om Ap-1 transcriptionele activiteit te remmen (Fig. 5D). Om te bepalen of KLF2 en PCAF met elkaar interageren, voerden we GST pull-down en coimmunoprecipitation assays uit. Gebruikend in vitro getranscribeerd en vertaalde producten, vonden wij dat KLF2 en PCAF direct in een cel-vrij systeem kunnen interageren (Fig. 4 B). Om te weten of PCAF in vivo bindt aan KLF2, hebben we KLF2 (hemagglutinine-tagged) en PCAF (Flag-tagged) in COS-7-cellen overexpresseerd. Immunoprecipitation met een anti-vlag antilichaam gevolgd door Western blotting met een anti-hemagglutinin antilichaam toonde aan dat KLF2 bindt met PCAF in cellen (Fig. 4 C).

om te bepalen of de mechanismen die ten grondslag liggen aan de waargenomen effecten werkzaam zijn in vivo, hebben we chromatin immunoprecipitation (ChIP) studies uitgevoerd. Zoals verwacht leidde LPS-stimulatie van THP-1-cellen tot de rekrutering van p65 en PCAF voor de COX-2-promotor (Fig. 4 D). Daarnaast werd gelijktijdige acetylering van HH3 en HH4 waargenomen. In de context van KLF2-overexpressie zijn PCAF-rekrutering en Histon-acetylering echter beide sterk verzwakt (Fig. 4 D). In overeenstemming met onze gel-shift assays werd geen significant effect van KLF2 waargenomen op P65 rekrutering.