discussie
de waargenomen productie van hoge niveaus van protease-activiteit tijdens continue kweek van K. sedentarius vergemakkelijkt de zuivering van twee proteasen, P1 en P2, die actief waren tegen azocaseïne, De β‐keten van insuline, keratine geëxtraheerd uit menselijke eelt en onbewerkte eelt. De Algemene kenmerken van deze enzymen, waaronder substraat bereik, optimale temperatuur en pH en gevoeligheid voor proteaseremmers suggereren dat ze biochemisch vergelijkbaar zijn en waarschijnlijk tot de alkalische serine protease familie behoren. Deze proteasen worden geproduceerd door een grote verscheidenheid aan micro-organismen en fungeren als endopeptidasen (Rao et al. 1998).
of de enzymen ook als keratinasen kunnen worden geclassificeerd, blijft echter een kwestie van discussie. Keratinases zouden per definitie in staat moeten zijn zuivere inheemse keratine te hydrolyseren. De extractie van keratine, echter, kan slechts door voorafgaande behandeling met denaturerende agenten worden bereikt om het van niet‐keratinproteã nen te scheiden. Mechanische behandelingen zoals kogelmalen resulteren in splitsing van disulfidebindingen, die het eiwit gevoeliger maken voor proteolytische vertering door proteasen zoals trypsine en proteïnase K, die niet geclassificeerd zijn als keratinases (Noval en Nickerson 1959). Evenzo, is het gebruik van hitte‐gesteriliseerde substraten in keratinaseanalyses ook bekritiseerd omdat het verwarmen keratin denaturatie kan veroorzaken.
hoewel in dit onderzoek fijngemalen eelt werd gebruikt als enzymsubstraat, was het supernatans in cultuur actief tegen stukjes intacte eelt. Daarom, zelfs als de twee proteasen niet strikt keratinasen zijn, ze degraderen menselijke eelt in vitro en er is enig bewijs dat dit ook in vivo gebeurt (Nordstrom et al. 1987).
proteasen zijn ook geclassificeerd als keratinasen als gevolg van hun activiteit op gereduceerde keratine, in welk geval reductiemiddelen zijn toegevoegd aan het enzymassaymengsel of gebruikt tijdens keratineextractie. Hoewel de keratinolytische activiteit van een reeks huidbacteriën is bestudeerd met behulp van ‘inheemse’ keratine als substraat, werd het reductiemiddel, dithiothreitol (DTT), opgenomen in het assaymengsel. Wanneer bijvoorbeeld de schijnbare keratinase-activiteit van Staphylococcus epidermidis werd bestudeerd in afwezigheid van DTT, werd er geen activiteit gedetecteerd (Mikx en de Jong 1987). Evenzo, een serine protease van Candida albicans-gedegradeerde keratines die waren geëxtraheerd uit het stratum corneum van menselijke zolen met 8 mol L-1 ureum in Tris-HCl en β-mercaptoethanol (Hattori et al. 1984). In dit onderzoek hebben P1 en P2 keratine gehydrolyseerd die met ureum en β‐mercaptoethanol uit menselijke voet eelt was geëxtraheerd, maar, wat nog belangrijker is, ook onbehandelde eelt kon degraderen.
het stratum corneum en menselijke eelt is een complexe en stabiele structuur waarvan keratine een belangrijke component is. Er zijn 30 menselijke genen voor keratine waarvan er 18 op de huid tot expressie komen (Fuchs 1995). Een samenvatting van de keratine database heeft aangetoond dat elke keratine potentiële splitsingsplaatsen voor de proteasen heeft en Asp‐Arg en Gly‐Arg zijn de gemeenschappelijkste. Als de keratinedraden aanvankelijk bij deze plaatsen worden gebroken, is het mogelijk dat de geleidelijke degradatie van deze kleinere eenheden bij secundaire splitsingsplaatsen voorkomt, veroorzakend een groottewaaier van peptide fragmenten, zoals getoond door analyse van de protease aanval op keratins uit menselijke eelt wordt gehaald. De in Fig. 3b wijzen op twee pH-optima voor de eeltafbrekende activiteit van P2. Een mogelijke verklaring is dat er twee enzymen in het monster zitten. Dit lijkt onwaarschijnlijk omdat het gebruikte enzymmonster sterk gezuiverd was, zoals blijkt uit pagina met zilverkleuring (zie Fig. 1, rijstrook 6). De mogelijkheid van twee eeltafbrekende enzymen in het gezuiverde P2‐monster met een zeer vergelijkbare mobiliteit op pagina kan niet worden uitgesloten. Hetzelfde monster werd echter getest met dezelfde buffers met de azocaseïnetest en er werd slechts één pH-optimum gedetecteerd bij pH 10 * 2. Een alternatieve verklaring is dat de complexe eelt substraat/enzym interactie bij verschillende pHs is een balans van enzymactiviteit en subtiele conformationele veranderingen van het substraat, die leidt tot dubbele pH optima.
dit onderzoek heeft aangetoond dat K. sedentarius twee extracellulaire proteasen produceert die eeltafbrekende activiteit hebben. Basisinformatie over hun relatieve moleculaire grootte, hun Pi ‘ s, zijn bepaald. Conventionele enzymkinetische studies konden echter niet worden aangepakt omdat het natuurlijke substraat dat in deze in vitro experimenten werd gebruikt een complex mengsel van polymeren was, onoplosbaar in water. De verhoogde enzymactiviteit van P2 in aanwezigheid van 800 mmol 1-1 zout kan relevant zijn voor de overleving van het micro-organisme op de menselijke huid, die een veranderende zoutconcentratie heeft, afhankelijk van de activiteit van de eccrineklier, bepaald door de inspanningssnelheid en omgevingstemperaturen van de persoon. Het(de) mechanisme (n) dat (die) betrokken is (zijn) bij het natriumchloride-effect is (zijn) niet behandeld. Er wordt voorlopig gesuggereerd dat natriumchloride de tertiaire structuur van het enzym en het substraat kan beïnvloeden, of beide, om de toegang van de actieve plaats van de enzymen tot de specifieke splitsingsplaatsen van het substraat te verbeteren.
de eenvoudigste verklaring voor de waargenomen resultaten is dat er in een kweek supernatant van K. sedentarius twee eeltafbrekende enzymen zijn, serine proteasen, die ook menselijke keratine in eelt oplossen. Het is mogelijk dat K. sedentarius produceert één protease, gecodeerd door één gen, en die autokatalytische of andere protease-activiteit produceert twee enzymen met verschillende molecuulgewichten. Alternatief, zijn er twee genen die twee onafhankelijke en nauw verwante enzymen coderen. Deze laatste hypothese wordt ondersteund door een eerdere studie (Holland et al. 1992). Monsters van continue kweek van K. sedentarius bij steady-state bij verschillende verdunningssnelheden die op bladzijde werden geanalyseerd en met caseïne waren bedekt, toonden twee enzymen aan, waarvan de ene constitutief was en de andere bij hoge concentraties bij lage verdunningssnelheden. Belangrijk is dat bij verdunningssnelheden in de buurt van µmax het niet werd gedetecteerd. De bepaling van de N-terminale aminozuursequentie van P1 (21 residuen) en P2 (15 residuen) polypeptiden toonde aan dat deze totaal verschillend waren. Dit resultaat, samen met de informatie van het continue cultuurexperiment genomen, zou suggereren dat de enzymen onafhankelijk gecodeerd zijn.
de resultaten van dit onderzoek hebben de hypothese versterkt dat specifieke proteasen van K. sedentarius de afbraak van eelt kunnen verklaren die kenmerkend is voor ontpitte keratolyse. Het bewijs tot nu toe suggereert ook dat twee proteasen betrokken zijn en dat ze actief zijn bij de pH van de huidplaats, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). De interpretatie van de resultaten van in vitro experimenten naar de in vivo omgeving kan in vraag worden gesteld, hoewel menselijke eelt werd gebruikt als substraat. Idealiter moeten menselijke huidbiopten worden genomen, inclusief delen van de normale en ontpitte huid. De aanwezigheid en de plaats of afwezigheid van de proteasen kunnen dan worden bepaald door histologische technieken met behulp van monoklonale antilichamen als sondes voor de proteasen en K. sedentarius. Echter, ethische goedkeuring zou niet worden gegeven voor biopten van de vereiste locatie, de dragende plaats van de voet, van een representatief aantal mensen. De betrokkenheid van K. sedentarius bij ontpitte keratytose door een mechanisme van productie van proteasen die keratine afbreken is niet formeel bewezen. Er zijn echter geen bewijzen die de hypothesen weerleggen en de geloofwaardigheid ervan is versterkt door de hier gepresenteerde resultaten. Er is sterk in vitro bewijs gepresenteerd dat K. sedentarius en zijn extracellulaire eeltafbrekende enzymen impliceren in de toestand ontpit keratolyse. Bij normale huid pHs en oppervlakte hydratatie zal de productie en activiteit van deze enzymen laag zijn, met P1 als actiever. Onder omgevingsomstandigheden van occlusie en bij slechte hygeine, beweegt de pH van de huid naar en iets boven neutraliteit. Deze voorwaarden bevoordelen P2. Beide enzymen zijn hoogstwaarschijnlijk opruimende enzymen, waardoor K. sedentarius koolstof-en stikstofbronnen kan verkrijgen, kleine peptiden, opgesloten in het residentiële en onoplosbare complexe polymeer, keratine. Momenteel is de regulering van de productie van deze enzymen onbekend, evenals hun relatieve bijdrage aan de afbraak van eelt in vivo. Naast de klinische implicaties, hebben keratinolytische proteasen aanzienlijke waarde voor de commerciële sector aangezien zij nuttig zijn in een aantal industriële processen met inbegrip van degradatie van keratine‐afval van de pluimvee-en leerindustrie (Shih 1993; Onifade et al. 1998). De hoge keratinolytische activiteit van de K. sedentarius proteasen bij relatief lage temperaturen en pH, in vergelijking met veel andere proteasen, presenteert een potentiële toepassing van deze enzymen in de biotechnologische industrie.
