zebravis onderhoud en bestanden: zebravis (Danio rerio) werden verhoogd en gefaseerd volgens vastgestelde protocols30.Transgene lijnen gebruikt werden Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(UAS:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 en Tg (kdrl:EGFP)s84337. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van RIKEN Kobe Branch (IACUC).
plasmiden en oligonucleotiden: zebravis marcksl1a, marcksl1b en fscn1a werden gekloond met PCR uit cDNA van 1 DPF-embryo ‘ s met behulp van NEB® PCR-Kloneringsset. Alle expressie constructies gebruikt in deze studie werden gegenereerd via de gateway® klonen en/of in-Fusion® klonen met behulp van plasmiden van Tol2Kit38. Plasmiden met gemuteerde Marcksl1a en Marcksl1b werden gegenereerd met behulp van Q5® Site-Directed mutagenesis kit (NEB). shRNA bevat vectoren werden geconstrueerd door afbinding van shRNA sequentie tussen de ecori en PmeI sites stroomafwaarts van de U6 promotor van gemodificeerde pEGFP-U6 vector39 (een geschenk van Zuoshang Xu, Addgene plasmide # 19799). Doelvolgorde voor menselijke MARCKSL1 is 5 ‘- GTGTGAACGAACAGATGATG-3’. De scrambled shRNA sequence 5 ‘- GAGTCATGGTCAGTTATATG-3 ‘ werd ontworpen als een niet-overeenkomende sequentie (onderstreept) van MARCKSL1 shRNA. Vectoren met mouse Marcksl1, Marcksl1-s120a/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) en Marcksl1-S120D/T148D/T183D (Marcksl1-DDD) gesubcloneerd in pEGFP-N1 (Clontech)10 waren geschenken van Eleanor T. Coffey (Universiteit van Turku). Een gedetailleerde informatie over plasmiden en primers die in deze studie worden gebruikt, is te vinden in respectievelijk de aanvullende tabellen 1 en 2.
RNA-isolatie en cDNA-synthese: Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van TRI-reagens (epigenetica) en de Direct-zolTM RNA MicroPrep kit (Zymo Research) en cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van het SuperScript III® First-Strand synthesis system (Invitrogen) volgens de protocollen van de fabrikant.
mozaïekexpressie van constructies en transgene zebravislijnen: Tol2-gebaseerde expressie constructies (5-10 pg) werden gelijktijdig geïnjecteerd in een-cel Stadium zebravis embryo ‘ s met 50 pg Tol2 transposase mRNA getranscribeerd van NotI-linearized pCS-TP vector (een geschenk van Koichi Kawakami, National Institute of Genetics, Japan) met behulp van de mMESSAGE mMACHINE SP6 kit (Invitrogen). Voor mozaïekexpressie van transgenen werden embryo ‘ s geanalyseerd bij 1 of 2 dpf na injecties. Om TG(fli1ep:MYL9B-EGFP)rk25 en TG(fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26 lijnen te genereren, werden geïnjecteerde embryo ‘ s verhoogd tot volwassenen en gescreend op stichters.
generatie van zebravis marcksl1a en marcksl1b mutanten: marcksl1a mutanten werden gegenereerd door CRISPR / Cas9-gemedieerde mutagenese. Een enig-gidsrna (sgRNA) richtend de tweede exon (aanvullende Fig. 4a) werd gegenereerd door het gebruik van klonen-onafhankelijk protocol40. Cas9 / sgRNA RNP complex werd samengesteld vlak voor injectie en na 5 min incubatie bij kamertemperatuur werden 200 pg Cas9 eiwit (Invitrogen)en 100 pg sgRNA gelijktijdig geïnjecteerd in één-cel Stadium TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-mCherry) s916 embryo. marcksl1b mutanten werden gegenereerd door TALENGEMEDIEERDE mutagenese. TALEN gericht op de eerste exon van marcksl1b (aanvullende Fig. 4b) werd ontworpen gebruikend TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) en werden geassembleerd via de Golden Gate method 41. TALEN repeat variable di-residu ’s (RVD’ s) werden gekloond tot een Rciscript-Goldytalenvector (Addgene) en afgetopte mRNAs voor elke TALENs werden in vitro getranscribeerd uit SacI-linearized expressie plasmiden met behulp van mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Eencellige fase Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 embryo ‘ s werden micro-geïnjecteerd met 200 PG RNA (100 pg van elke linker en rechter TALEN mRNAs). F0 stichters werden geïdentificeerd door outcrossing van TALEN of CRISPR/Cas9-geïnjecteerde vis met wildtype vis en screening van de nakomelingen op mutaties bij 2 dpf met behulp van T7 endonuclease I (NEB) assay (voor TALEN-geïnjecteerde vis) of Sanger sequencing (voor CRISPR/Cas9-geïnjecteerde vis). Kort, werd genomic DNA geà soleerd uit groepen van vijf embryo ‘ s gebruikend hotshot methode 42 en overeenkomstige genomic gebieden werden vergroot. Mutaties werden beoordeeld door directe sequencing van gezuiverde PCR-producten. F1-nakomelingen van positieve F0 werden volwassen en heterozygote dragers voor mutaties werden geïdentificeerd door middel van fin-clipping en routinematige genotypering PCR-analyse met dezelfde primers.
zes mutante allelen in marcksl1a en vijf mutante allelen in marcksl1b werden geïdentificeerd tijdens de screening (aanvullende Fig. 13). Allel rk23 herbergt een 2-nt deletie die leidt tot een frameshift na aminozuur 51 en premature stop codon bij aminozuur 56 na 5 missense aminozuren (aanvullende Fig. 4a, c). Allel rk24 bevat een 5-nt deletie die leidt tot een frameshift na aminozuur 13 en voortijdig stopcodon bij aminozuur 17 na 4 missense aminozuren (aanvullende Fig. 4 ter, d). Om deze redenen beschouwen wij marcksl1ark23 en marcksl1brk24 Als null allelen en richten ons onderzoek op de analyses van deze mutanten.
levende beeldvorming: embryo ‘ s werden verzameld in 0,8% laagsmelt agarose (Bio-Rad) in E3-medium met 0,16 mg/mL Tricaine en 0,003% fenylthioureum. Confocale z-stacks werden verkregen met behulp van een omgekeerde Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 spinning disc confocale microscoop uitgerust met een zyla 4.2 CMOS camera (Andor). Bright-field beelden werden verkregen op de Leica m205fa microscoop. Beelden werden verwerkt met behulp van Fiji (NIH).
laserablatie: Laserablaties werden uitgevoerd met behulp van een 405 nm laser (Andor) en FRAPPAMODULE (Andor), gemonteerd op een omgekeerde Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 confocale microscoop met een Olympus uplsapo 60x/na 1,2 waterdompelings objectief. Drie opeenvolgende laserablaties met een verblijftijd van 1000 µs elk werden toegepast bij 51% laservermogen.
Microangiografie: Microangiografie werd uitgevoerd in wild type, marcksl1ark23, marcksl1brk24 en marcksl1ark23; marcksl1brk24 embryo ‘ s. In totaal werden 2 en 3 DPF embryo ‘ s geïnjecteerd met 1-2 nl dextran tetramethyl rhodamine of dextran fluoresceïne (MW = 2000 kDa, Invitrogen) bij 10 mg/mL en onmiddellijk afgebeeld. Confocal z-stacks werden verworven met een Olympus uplsapo 10×/na 0.4 doel. Om het hele embryo te bedekken, werden verschillende regio ‘ s afgebeeld en gestikt met behulp van de Stitching plugin in Fiji43.
celtransplantatie: groepen van 15-25 donorcellen uit marcksl1ark23; marcksl1brk24 mutante embryo ’s in Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 achtergrond werden verzameld op een willekeurige positie in het blastoderm en getransplanteerd naar de laterale marginale zone in de blastoderm44 van wildtype ontvangende embryo’ s bij 4,5–6 hpf. Extractie en transplantatie werden uitgevoerd met behulp van een CellTram ® 4r olie micro-injector (Eppendorf) met een borosilicaatglas capillaire GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) vervaardigd met een horizontale micropipet p-87 (Sutter Instrument Co.) en een MF-900 microforge (Narishige) om een ‘lepel’ vorm gladde tip te verkrijgen. Tijdens transplantatie werden embryo ‘ s bewaard in met agarose beklede petrischaaltjes met 0,5 x E2 buffer . Bij 2 dpf werden embryo ’s met mcherry-positieve ISV’ s geselecteerd voor microangiografie en beeldvorming. In totaal werden acht onafhankelijke transplantaties uitgevoerd.
chemische behandelingen: Latrunculine B (Merck Millipore) werd opgelost in DMSO tot 1 mg/ml en bewaard bij -20 °C. CK666 (SIGMA) werd opgelost in DMSO tot 50 mM en bewaard bij 4 °C. Alle verbindingen werden verdund tot de gewenste concentratie in E3-Buffer.
transfectie, siRNA-gemedieerde proteïne knockdown en shear stress experiment: HUVECs (Lonza, C-2519A) werden gekweekt in EGM medium (Lonza) en gebruikt tot passage 4. Voor plasmidetransfecties werden cellen in Opti-MEM medium (Gibco) geplaatst bij 5,8 × 104 cellen/cm2 op poly-l-Lysine en gelatine-gecoate coverslips en getransfecteerd met 2 µg plasmide met behulp van Lipofectamine 3000 (Thermofisher Scientific). Twee uur na transfectie werd het Opti-MEM medium veranderd in EGM medium zonder antibiotica. Voor siRNA-transfectie, HUVECs (7.9 × 104 cellen/cm2) werden getransfecteerd met 20 nM siRNA met behulp van dharmafect1-reagens (Dharmacon). Transfectie werd herhaald na 24 uur. cellen werden gekweekt voor een extra 24 uur voor de totale RNA-extractie of fixatie. ON-TARGETplus human MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) werd gebruikt om marcksl1 neer te halen. ON-TARGETplus Non-target pool (Dharmacon) werd gebruikt als controle siRNA transfectie. Cellen werden gefixeerd met 4% PFA/PBS, permeabilized met 0,1% Triton X-100 en gekleurd met 14 µM DAPI voor kernen etikettering, Alexa 568-phalloidin (1:1000, ThermoFisher Scientific) voor het visualiseren van F-actine en anti-VE-cadherine antilichaam (1:100, Cell Signal) gevolgd door anti-rabbit Alexa 488 secundair antilichaam (1:1000, ThermoFisher Scientific) om EC-kruisingen te markeren.
voor shear stress experimenten werd HPAEC (Lonza) gekweekt in 1000-1500 cellen/mm2 op 1% gelatine gecoate schaal in EGM-2 medium (Lonza) en gebruikt voor passage 9. De cellen werden blootgesteld aan statische of laminaire schuifspanning bij 15 dyn / cm2 voor 0,5, 1 of 6 uur met behulp van een parallelle plaat-type apparaten 45,46. De ene kant van de stroomkamer bestond uit een 1% gelatine gecoate glasplaat waarop de gekweekte HPAECs rustten, en de andere kant bestond uit een polycarbonaat plaat. Hun vlakke oppervlakken werden 200 µm uit elkaar gehouden met een teflon pakking. De kamer was voorzien van een ingang en een uitgang voor de vloeistof, en de ingang was verbonden met een bovenste reservoir met een siliconen buis. De uitgang was open naar een lager reservoir. De stroom werd aangedreven door een roller/buispomp. De vloeistof (EGM – 2 medium) ging van het bovenste reservoir door de stroomkamer naar het onderste reservoir. Het debiet werd gemeten met een ultrasone doorvoertijdstroommeter (HT107, Transonische systemen) die bij de ingang werd geplaatst en werd gecontroleerd door het hoogteverschil tussen het bovenste reservoir en de uitgang van de debietkamer te wijzigen. De intensiteit van de schuifspanning (τ, dynes/cm2) die op de EG-laag inwerkt, werd berekend met behulp van de formule τ = 6µQ/a2b, waarbij μ de viscositeit van het perfusaat (poise) is, Q het stroomvolume (ml/s) is en a en b de doorsnede afmetingen van het stroompad (cm) zijn. Na blootstelling aan schuifspanning werd totaal RNA geïsoleerd voor qPCR.
kwantitatieve real-time PCR: qPCR werd uitgevoerd met 1 µL cDNA, gegenereerd uit 150 ng (HPAECs) of 500 ng (HUVECs) totaal RNA, in een reactiemix van 10 µL met 1x Luna Universal qPCR Mastermix (NEB) en 400 nM vooruit-en achteruitprimers. De reacties werden uitgevoerd op ABI Prism 7900HT instrument in viervoud. De gegevens werden geanalyseerd gebruikend de RQ Manager software (Applied Biosystems) en de relatieve uitdrukking van MARCKSL1 mRNA werd berekend met de 2−ΔΔCt method47 gebruikend GAPDH als referentiegen.
hybridisatie van gehele mount in situ: De gehele zet in situ kruising op werd geleid volgens standaardprotocol48. Embryo ‘ s werden gefixeerd in 4% PFA bij 24, 48 en 72 hpf en permeabilized met 10 µg/mL proteïnase K. hybridisatie werd uitgevoerd in buffer met 5% natriumdextraan sulfaat (MW = 500 kDa) bij 70 °C overnachting. Na stringency wash werden de monsters Geblokkeerd met 2% blocking reagens (Roche) in maleïnezuurbuffer en ’s nachts geïncubeerd met anti-digoxigenine (DIG) antilichaam, geconjugeerd met alkalische fosfatase (Roche, 1:5000) bij 4 °C. embryo’ s werden gekleurd met NBT/BCIP-oplossing (Roche) in kleuringbuffer . Embryo ’s werden geklaard in 70% glycerol’ s nachts en imaged met behulp van Leica m205fa microscoop. De marcksl1a en marcksl1b DIG-gelabelde 1.2 kb lange riboprobes werden gegenereerd uit plasmiden coderen van de volledige cDNA ‘ s met behulp van Megascript SP6 of T7 kits (Invitrogen).
single-cell RNA sequencing: ECs werden geïsoleerd uit TG (KDRL: EGFP)s843 transgene embryo ‘ s. Cel Sorteren werd uitgevoerd met FACSAriaII cel Sorter (Bd Bioscience). Eencellige suspensie werd geladen in het 10x Chromium systeem en cDNA bibliotheken werden gebouwd met behulp van Chromium Next GEM Single Cell 3 ‘ GEM, bibliotheek en Gel Bead Kit v2 (10x Genomics) volgens het Protocol van de fabrikant. Library werd gesequenced op de Illumina Hiseq 1500 Sequencer (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1 werd gebruikt om de-multiplex raw base call (BCL) bestanden gegenereerd door Illumina sequencers in FASTQ bestanden, het uitvoeren van de uitlijning, barcode tellen, en UMI tellen. Het rangschikken van Leest werden in kaart gebracht aan de assemblage van het zebrafishgenoom (GRCz11, Ensembl-versie 92). Verdere analyses werden uitgevoerd met Seurat package49 in R-software (https://www.r-project.org). De uitdrukkingsmatrices werden eerst gefilterd door genen te houden die in een minimum van 3 cellen worden uitgedrukt en cellen die een minimum van 200 genen voor stroomafwaartse analyse uitdrukten. Cellen werden verder gefilterd door cellen te selecteren met een laag mitochondriaal gehalte (<7%). De gegevens werden toen genormaliseerd gebruikend NormalizedData functie die de genuitdrukking voor elke cel door de totale uitdrukking normaliseert.
kwantificering van de bloedvatdiameter: levend TG (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 transgene wildtype of marcksl1 mutante embryo ‘ s werden afgebeeld op 50-52 hpf. Confocale z-stacks werden verworven met een Olympus uplsapo 40×/NA1.25 siliconenolie immersie objective. Voor DA-en PCV-diameterberekeningen werden 4-5 metingen verricht tussen ISVs langs de dooieruitbreiding (ISVs nr. 10-14). Voor de ISV diameter werden gemiddeld 6 metingen gedaan langs elke ISV (ISVs nr. 10-14) tussen de DA en de DLAV. Metingen werden gedaan met behulp van Fiji (NIH).
kwantificering van EG-nummer en proliferatie: Om EC-nummer te tellen, 52 HPF wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 of marcksl1ark23; marcksl1brk24 embryo ‘ s in Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 achtergrond werden vastgesteld in 4% PFA en gekleurd met 3 µM DAPI. Confocale z-stacks werden verworven met een Olympus uplsapo 40x / na 1.25 siliconen olie immersie objective. Kernen werden geteld in elke ISV (ISVs nr. 9-22) tussen de DA en de DLAV. Mitotische ECs kwantificeren in ISVs, wildtype of marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryo ‘ s in Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 achtergrond werden gefixeerd in 4% PFA bij 30, 36 en 48 hpf, gepermeabiliseerd in 1% DMSO/1% Triton X-100 en gekleurd met anti-fosfo H3 antilichaam (1:250, Merck Millipore) gevolgd door anti-konijn Alexa 488 secundair antilichaam (1: 1000, Thermofisher wetenschappelijk) en 3 µM DAPI. Confocale z-stacks werden verworven met een Olympus uplsapo 40x / na 1.25 siliconen olie immersie objective. Mitotische cellen (pH3-positieve cellen) werden geteld in ISVs aan beide zijden van het embryo (ISVs nr. 9-22). ISVs werd gevisualiseerd gebruikend mcherry fluorescentie. Er werd slechts één pH3-positieve cel per ISV gedetecteerd, ongeacht de ISV-positie. Tijdens het tellen beschouwden we EC in telofase als een enkele cel. Om het aantal EC divisies te tellen, wildtype of marcksl1ark23;marcksl1brk24 embryo ‘ s in Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG(kdr-l:ras-mCherry)s916 achtergrond werden afgebeeld van 24 tot 48 hpf met intervallen van 6 minuten met behulp van een Olympus UPLSAPO 30×/na 1.05 silicone olie immersion objective. Het aantal celdelingen in elke ISV (ISVs nr. 11-15) werd gekwantificeerd.
kwantificering van actomyosineniveaus in de apicale cortex: levend TG (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Tg(fli1ep:EGFP-PLCδ1PH)rk26 en Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 zebravis embryo ‘ s werden afgebeeld op 30-34 hpf met behulp van een Olympus UPLSAPO 60×/na 1.2 water immersion objective. De intensiteit van Lifeact of Myl9b langs de apicale cortex en in het cytoplasma werd gemeten gebruikend Fiji. De verhouding tussen de gemiddelde corticale en cytoplasmatische intensiteit werd berekend.
in vivo celvormanalyse: eencellige etikettering van ECs in ISVs werd bereikt door mozaïekexpressie van ofwel fl61ep: lynEGFP plasmide in wildtype, marcksl1brk24 of marcksl1ark23; marcksl1brk24 mutante embryo ‘ s of fl61ep:marcksl1b-EGFP plasmide in wildtype embryo ‘ s. Bij 2 dpf, werd microangiografie uitgevoerd en schepen werden afgebeeld met een Olympus UPLSAPO 60× / na 1,2 waterdompelings doel met optische z-vlakken interval van 0,25 µm. Cell shape analyse van ECs van ISVs werd uitgevoerd op een semi-geautomatiseerde manier met behulp van een custom-written ImageJ script ontwikkeld in Python, uitbreiding van de methode beschreven in ref. 50. Beelden werden eerst ruw bijgesneden om downstream geheugenvereisten te verminderen en aanvullende metadata (type vaartuig en embryo-identificatie) werden bevolkt. Een apart script werd vervolgens uitgevoerd om cellen van rond een vat op een 2D-oppervlak te projecteren en uit te pakken. Kort, werden de bijgesneden beelden eerst geroteerd gebaseerd op vesseltype om de vesselas ruw met de Z-richting in een beeldstapel uit te lijnen, en het kanaal van het fluorescente etiket van de mozaïekcel werd voor projectie geselecteerd. Om problemen met geautomatiseerde vatsegmentatie in het bloed zwembad fluorescentie kanaal veroorzaakt door variabele fluorescerende achtergrondstructuren en perfusie van dextran-rhodamine buiten het vat te overwinnen, werd de vat as geïdentificeerd door handmatig definiëren van de positie van het vat ongeveer elke 10 µm door de afbeelding stack en vervolgens het uitvoeren van een Catmull-Rom spline fit en interpolatie. De gegevens werden vervolgens getransformeerd om de as van het vat in drie dimensies recht te zetten. Vervolgens werd de positie van de maximale intensiteit in het projectiekanaal geïdentificeerd langs stralen met intervallen van 1° rond de vaatas. Deze informatie werd gebruikt om fluorescentieintensiteit op een vlak te projecteren waar de assen positie langs de vaartuigas en hoekpositie zijn, en om afstand van de vaartuigas bij elke positie op het geprojecteerde vlak in kaart te brengen. De cel werd geïdentificeerd van het geprojecteerde beeld met behulp van ImageJ ingebouwde Intermodes methode. De booglengtes vertegenwoordigd door de zijden van elke pixel die met de cel geassocieerd is, werden vervolgens berekend (\(l = \frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), waarin r de afstand tussen cel-geassocieerde pixel en de vatas is en d de kant van een pixel is) en wordt gebruikt om metingen van celoppervlakte en beeldverhouding te genereren.
in vitro celvormanalyse: vaste HUVECs werden afgebeeld met een Olympus uplsapo 40×/na 1,25 siliconenolie immersie objective. In totaal werden 10-20 beelden van elke cover slip genomen voor kwantificering en geanalyseerd op een semi-geautomatiseerde manier met behulp van een op maat geschreven ImageJ script. Multi-channel z-stacks werden maximaal geprojecteerd en het kanaal dat een teller GFP toont werd geà dentificeerd van instrumentmetadata. ImageJ ’s ingebouwde Otsu-drempelmethode werd gebruikt om cellen van belang te scheiden van de achtergrond; resulterende binaire beelden werden gereinigd door het verwijderen van regio’ s kleiner dan 105 µm2 en regio ‘ s in contact met de grens van het gezichtsveld. Een volgende handmatige interventiestap stelde de gebruiker in staat om optioneel celgebieden van belang te wijzigen op basis van deze binaire afbeelding om foutief samengevoegde cellen te scheiden of cellen op te nemen die door de drempelbewerking werden gemist. Het script berekende vervolgens gebieden en perimeters voor elke cel ROI. Bovendien werd voor elke cel een’ spikiness index ‘ berekend op basis van de verhouding tussen de celomtrek en de omtrek van de corresponderende convexe romp, en werd een waarde voor de beeldverhouding van de cel berekend als de verhouding tussen de hoofd-en kleine assen van een ellips gemonteerd op de cel ROI.
analyse van membraanbling: grafieken met betrekking tot de membraanbling werden gegenereerd op een semi-geautomatiseerde manier met behulp van een op maat geschreven ImageJ-script. Voor elk afgebeeld membraan werd op elk tijdstip de verhouding tussen de contourlengte van een membraanrand en de Euclidische afstand tussen de randeindpunten berekend. Uit de resulterende tijdreeks werden de spectrale vermogensdichtheden berekend volgens Welch ‘ s methode 51. De spectrale vermogensdichtheid werd vervolgens gemiddeld over een venster van belang, empirisch gedefinieerd als de karakteristieke tijd gedurende welke blebs gevormd (0,04–0,06 Hz); deze gemiddelde waarden werden vergeleken tussen experimentele (Marksl1b overexpressie) en controleomstandigheden.
analyse van de dynamica van actine en myosine II in blebs: Plots met betrekking tot de dynamiek van actin of myosine in blebbing cellen werden gegenereerd in een semi-geautomatiseerde manier met behulp van een op maat geschreven ImageJ script. Multichannel time-lapse z-stacks werden eerst maximaal geprojecteerd langs de Z-dimensie. De software identificeerde vervolgens automatisch de rand van een bleb tussen twee door de gebruiker gedefinieerde ankerpunten op alle tijdpunten met behulp van ImageJ ‘ s ingebouwde Otsu-drempelmethode die op het Marksl1b-EGFP-kanaal wordt uitgevoerd als surrogaat voor membraanetikettering. Na een kwaliteitscontrolestap van de gebruiker om een nauwkeurige identificatie van de bleb edge te garanderen, werd het actin/myosine-kanaal intensiteitsprofiel langs de rand op elk tijdpunt geëxtraheerd en uitgezet tegen de tijd in een kymograaf. Op elk tijdstip intensiteit statistieken werden gehaald, samen met de blaar en omgeving, hier gedefinieerd als de z-geprojecteerde oppervlakte ingesloten door de rand en de lijn die de punten aan beide kanten van de blaar die het verst van de blaar tip langs een as die loodrecht staat op de verbindingslijn van de door de gebruiker gedefinieerde ankerpunten, en de gemiddelde actine/myosin kanaal intensiteit en de blaar gebied werden uitgezet tegen de tijd.
kwantificering van corticale actinedichtheid en bundelbreedte: De hoge resolutiebeelden van actin in HUVECs werden verworven gebruikend een Plan-APOCHROMAT 63x olie objectieve lens die op een Zeiss lsm880 confocal microscoop wordt opgezet die met een airyscan en Gaasp detector wordt uitgerust. Ongeveer 3 µm kwadraat regio ’s binnen elke waarneming werden willekeurig geselecteerd en bijgesneden typisch 8 optische secties die het corticale mazenwerk uit deze regio’ s. Geprojecteerde beelden langs de Z-as van bijgesneden stapels werden gegenereerd door maximale intensiteit projectie en onderworpen aan de volgende procedure. Aangezien actin filamenten binnen het beeld dubbelzinnig waren en het onmogelijk was om het hele netwerk te evalueren, kwantificeerden wij het aantal actin filamenten binnen de beperkte gebieden als de dichtheid van actin meshwork. Dit werd uitgevoerd door het instellen van scanlijnen langs X – en Y – assen op elke 4 pixels, en pixelwaarden langs elke scanlijn werden onderworpen aan de savitzky-Golay filter52 om de eerste orde derivaten te berekenen. Actin filamenten werden toen geà dentificeerd door nul-kruispunten te vinden, die de intensiteitspieken van de aftastenlijn zijn. Tellingen voor pieken werden gedeeld door de pixeltellingen van de scanlijn (breedte of hoogte van de afbeelding) en de dichtheid van de filamenten over de afbeelding werd berekend door het gemiddelde van deze waarden te nemen.
om de breedte van de actinebundel te kwantificeren, werden de centrische lijnen van de actinebundels gegenereerd door het vinden van nuldoorlaatpunten van eerste-orde-derivaten berekend door het savitzky-Golay-filter en gevolgd door het hilditch-verdunningsalgoritme toe te passen. Om een mogelijkheid te elimineren dat vertakking – of kruispunten van de actine filamenten metingen beïnvloeden, werden vertakking punten gevonden binnen de skeletonized lijn geëlimineerd en gesegmenteerd. De orthogonale as tot het totale segment werd bepaald door het verkrijgen van de eigenvector, en fluorescente intensiteiten werden bemonsterd langs de orthogonale as die het zwaartepunt van het segment met de Lanczos-5 interpolatie methode. Vervolgens werd de diameter van een gloeidraad bepaald door de breedte van het gebied dat groter of gelijk was aan de helft van de piekintensiteit binnen de bemonsterde lijn langs de orthogonale as tot het totale segment.Statistieken: statistische analyse werd uitgevoerd met Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). De steekproefgrootte was niet vooraf bepaald, de experimenten waren niet gerandomiseerd en de onderzoekers waren niet geblindeerd voor toewijzing tijdens experimenten en resultaatbeoordeling.
Rapportagesamenvatting
nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.
