Deletie van KDM6A, een Histone Demethylase die interageert met MLL2, bij drie patiënten met Kabuki syndroom | Jumbuck

hoofdtekst

Kabuki syndroom (KS; MIM 147920) werd voor het eerst beschreven in 1981 door Niikawa en Kuroki,1,2 en meer dan 400 gevallen zijn gemeld in de literatuur. De belangrijkste klinische kenmerken zijn onderscheidende gelaatstrekken, ontwikkelingsachterstand, milde tot matige intellectuele handicap, postnatale groeivertraging, en aanvullende kenmerken, waaronder skeletafwijkingen, hypodontie, en aanhoudende foetale vingertoppen. De vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) microarray analyse mislukte om een terugkomende anomalie in 72 KS individuen te ontdekken.3-8 het gebruik van de exome-rangschikkende strategie leidde onlangs tot de identificatie van veranderingen MLL2 (MIM 602113) als belangrijke oorzaak van KS.9 in vijf recent gepubliceerde reeksen, werden veranderingen in MLL2 gevonden in 56%-76% van KS patiënten.9-13

omdat een significant deel van de patiënten geen detecteerbare MLL2-mutatie heeft, veronderstelden we het bestaan van extra genen geassocieerd met KS. In de zoektocht naar een andere KS-veroorzakende genetische mutatie, werden tien genen die met MLL2 interageren onderzocht in 15 MLL2-mutatie-negatieve KS individuen, en werden geen pathogene mutaties geà dentificeerd.11 Een ander gen dat codeert voor een MLL2-interagerende proteã ne, KDM6A (voorheen bekend als UTX; MIM 300128), werd gescreend in 22 MLL2-mutatie-negatieve KS individuen, en opnieuw, werden geen veroorzakende veranderingen ontdekt.13

door gebruik te maken van array CGH analyse (Agilent platform 244K), identificeerden we de novo Xp11.3 microdeleties bij twee Belgische MLL2-mutatie-negatieve KS meisjes (patiënten 1 en 2). Omdat beide verwijderingen de novo waren, zijn ze waarschijnlijk pathogeen. Beide verwijderingen omvatten ofwel een deel van of alle KDM6A. bovendien waren er in een vorige studie geen verwijderingen van KDM6A in een cohort van 411 normale controles.14 de schrapping in patiënt 1 omvatte kdm6a exons 21-29, die voor het einddeel van het katalytische domein van KDM6A coderen, en CXorf36, een gen onlangs betrokken bij X-verbonden autisme.Bij patiënt 2 werden KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) en FUNDC1 (figuur 1) volledig verwijderd. De functies van DUSP21 en FUNDC1 blijven onbekend.

Regio Xp11. 3 toont de verwijderingen

Regio Xp11.3 toont de verwijderingen uit de UCSC-Genoombrowser (GRCh37/hg19) voor patiënten 1, 2 en 3. De zwarte volledige tracks vertegenwoordigen de verwijdering van elke patiënt, en het nummer van elke patiënt is boven zijn of haar respectievelijke track. De deletie in patiënt 1 overspant 283.5 kb van basis 44.941.324 tot basis 45.224.829, de deletie van patiënt 2 overspant 815.7 kb van basis 44.377.858 tot basis 45.193.629, en de verwijdering van patiënt 3 omvat 45.4 kb van basis 44.866.302 tot basis 44.912.718. De genen in het gebied worden genoteerd onder de schrappingsporen. CNVs in de Database van genomische varianten worden getoond op de onderste lijnen. Er zijn geen eerdere meldingen van wijzigingen in het kopieernummer van KDM6A.

we sequentieerden toen KDM6A door sanger te rangschikken en zochten naar intragenic schrappingen of duplicaties met een gerichte aangepaste Agilent array CGH in een cohort van 22 MLL2-mutatie-negatieve KS individuen (8 wijfjes, 14 mannetjes). In overeenstemming met de ethische normen van het Institut de Pathologie et de Génétique ethische commissie werd toestemming van de ouders verkregen voor DNA-analyse van alle deelnemers aan deze studie en voor de publicatie van foto ‘ s. De CGH microarray gegevens (aanvullende gegevens, online beschikbaar) besproken in deze publicatie zijn gedeponeerd in het National Center for Biotechnology Information (NCBI) genexpressie Omnibus (GEO)16 en zijn toegankelijk onder toetreding GSE32567 (Zie sectie Toetredingsnummers).

er werden geen puntmutaties gedetecteerd, maar we identificeerden een de novo intragene deletie (exons 5-9) bij één Italiaanse, mannelijke KS-persoon (patiënt 3). We sequenced ook UTY (MIM 400009), de Y chromosoom paralog van KDM6A (zie hieronder), en zocht naar intragenic deleties of duplicaties zoals hierboven vermeld, maar we hebben geen mutaties ontdekt.

patiënten 1 en 3 hadden een typisch KS-fenotype, waaronder lange palpebrale fissuren, laterale eversie van het onderste ooglid en matige tot ernstige verstandelijke beperking (Tabel 1 en Figuur 2). Hoewel de gelaatstrekken van patiënt 2 niet zo klassiek waren, vertoonde ze veel kenmerken van deze aandoening, waaronder laterale sparseness van de wenkbrauwen, lange wimpers, scheelzien, lange palpebrale fissuren, grote en prominente oren, aanhoudende foetale vingertoppen, aorta coarctatie, areolaire volheid in de kindertijd, en hirsutisme. Ze presenteerde zich met een lichte ontwikkelingsachterstand en had een normale verbale intelligentie quotiënt (IQ) score, een slechte prestaties IQ score, en hyperactief gedrag (Tabel 1 en Figuur 2). We merkten op dat patiënten 1 en 2 lange hallucinaties hadden (Figuur 3).

Gezichtsverschijning bij betrokken personen

(a) patiënt 1.

(B) Patiënt 2.

(C) Patiënt 3.

noteer de lange palpebrale fissuren bij patiënten 1 en 2 en de gebogen wenkbrauwen bij patiënten 1 (mild) en 3.

voorkomen van voeten bij aangetaste personen

(a) patiënt 1.

(B) Patiënt 2.

noteer de lange hallucinaties bij beide patiënten.

de kdm6a-deleties bij deze drie patiënten zijn dus geassocieerd met een breed fenotypisch spectrum variërend van typische KS-individuen (patiënten 1 en 3) tot een mildere klinische presentatie (patiënt 2). Deze klinische variabiliteit is ook een kenmerk van patiënten met MLL2 mutaties.De mogelijke effecten van cxorf36-deletie bij patiënt 1 en van cxorf36 -, DUSP21-en FUNDC1-deletie bij patiënt 2 op hun respectievelijke fenotypen moeten echter ook worden overwogen.

KDM6A (29 exons) is een van de x-chromosomale genen die grotendeels ontsnapt aan X-inactivering.17 het codeert een 1401 residu-eiwit dat twee functionele domeinen bevat. Het katalytische domein is een histone demethylase dat specifiek demethylering van mono-, di-, en trimethylated lysine 27 op histone H3 (H3K27) katalyseert.18,19 deze demethylering bemiddelt weefsel-specifieke uitdrukking van diverse genen en is meestal betrokken bij ontwikkelingsprocessen en de celcyclus.19-22 interessant genoeg, werken KDM6A en MLL2 samen in de epigenetische controle van transcriptioneel actief chromatine door polycomb-groep (PcG) proteã nen tegen te gaan.Het andere functionele domein van KDM6A speelt een rol in chromatine remodellering door interactie met het SWITCH/sucrose nonfermentable (SWI/SNF) remodelleringscomplex dat de transcriptie activator Brg1.23

bevat zoals MLL2, speelt KDM6A een rol in embryogenese en ontwikkeling. Homozygote dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) Drosophila mutanten manifesteren ruwe ogen, dysmorfe vleugels, en wijziging van de geslachtskammen.21 Dit fenotype lijkt op het trithorax fenotype, wat het idee ondersteunt dat KDM6A PcG-onderdrukking tegengaat.21 bovendien, UTX – 1 (C. elegans KDM6A ortholog) kan invloed hebben op de ontwikkeling lot beslissingen in C. elegans vulval precursor cellen via de transcriptie regulatie van genen die coderen het retinoblastoma (RB) eiwit complex, dat is bewaard gebleven van wormen tot mensen.20 Kdm6a1 is ook belangrijk in de uitdrukking van posterior Hox genen in zebravis.19 bovendien speelt KDM6A, samen met MLL2, een belangrijke rol in de regulatie van spier-specifieke genen tijdens embryogenese.22,24 ten slotte werven leden van een andere belangrijke ontwikkelingsgenfamilie (T-box genen, die in het mesoderm werken bij de vorming van het hart en de wervels) KDM6A om hun doelgenen te activeren, opnieuw met nadruk op de rol van KDM6A in ontwikkelingsprocessen.23 interessant is dat de meeste pathogene mutaties voor gerapporteerde T-box genen in menselijke ziekten zich bevinden in het T-box domein dat in wisselwerking staat met KDM6A.23

KDM6A ontsnapt aan X-inactivatie, 17 maar er is gesuggereerd dat bij muizen de kdm6a-expressie van het inactieve X-chromosoom significant lager is dan die van het actieve X-chromosoom.De uitdrukking van 25 Kdm6a is hoger in de volwassen hersenen, de volwassen lever, en Specifieke zich ontwikkelende hersengebieden in wijfjes dan in mannetjes.25 UTY is paralog van KDM6A op het chromosoom van Y.UTY heeft 84% overeenkomst van de aminozuurvolgorde met KDM6A en zou voor de verhoogde uitdrukking van KDM6A in wijfjes kunnen compenseren, ondanks het feit dat demethylaseactiviteit voor deze paralog van kdm6a nog moet worden aangetoond.14,25

het is niet verwonderlijk dat een ander gen geassocieerd met KS op het X-chromosoom wordt gevonden omdat er meldingen zijn geweest van KS-achtige patiënten met kleine ring x (r) chromosomen.26-34 bovendien is er een duidelijke overlap tussen de aangeboren hartafwijkingen die voorkomen bij mannelijke KS-patiënten (aorta-coarctatie en andere linkszijdige obstructies) en die bij patiënten met monosomie X-en r(X) – chromosomen.28,35 kleine R(X) chromosomen leiden typisch tot het syndroom van Turner door de volledige inactivatie van r (X). Het is echter onduidelijk waarom sommige individuen een KS-achtig fenotype ontwikkelen. Onvolledige inactivatie van het X-chromosoom en de daaropvolgende expressie van gewoonlijk onderdrukte genen zijn voorgesteld als verklaring voor het KS-fenotype bij sommige r(X) – patiënten.32-34 KDM6A werd verwijderd bij de drie patiënten met zowel een KS-achtig fenotype als een r(X) waarin de breekpunten in kaart waren gebracht; deze bevinding is consistent met de hypothese dat kdm6a-deletie een belangrijke rol speelt in het KS-achtig fenotype dat is waargenomen bij sommige patiënten met een r(X).30,32,34 we waren niet in staat om haploinsufficiëntie voor KDM6A bij patiënten 1 en 2 te bewijzen omdat de kdm6a-expressie zeer laag was in perifere bloedlymfocyten (gegevens niet getoond). Niettemin, hebben studies aangetoond dat twee exemplaren van Kdm6a voor normale uitdrukking in vrouwelijke muizenembryo ‘ s en volwassen muizen noodzakelijk zijn,25 die suggereren dat haploinsufficiency het pathogene mechanisme zou kunnen zijn. Deze verklaring zou echter niet verklaren dat 45, X en andere R(X) patiënten met een kdm6a deletie niet allemaal het Kabuki fenotype ontwikkelen.

bij patiënten 1 en 2 zijn de moleculaire x-inactivatieverhoudingen sterk scheef en zijn respectievelijk 89:11 en 97:3. Het X-inactivatieprofiel werd bepaald door middel van PCR-versterking van de CAG-herhaling in exon 1 van het androgeenreceptorgen vóór en na de DNA-vertering met HpaII en CfoI. Om te bepalen of het verwijderde exemplaar van KDM6A zich op het actieve of inactieve X-chromosoom bevond, voerden we fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) analyse uit met een kdm6a-sonde op de X-chromosomen die differentieel geëtiketteerd waren door de integratie van 5-bromo-2′ – deoxyuridine (5-BrdU). De resultaten toonden aan dat de verwijderde kopie van KDM6A zich op het inactieve X-chromosoom bevond in alle 70 mitoses die bij beide patiënten werden geanalyseerd (Figuur 4). Het feit dat KDM6A ontsnapt aan X-inactivatie17 suggereert dat de fytohemagglutinine (PHA)-gestimuleerde lymfocyten die een geschrapt exemplaar van KDM6A op het inactieve chromosoom van X hebben een overlevingsvoordeel ten opzichte van cellijnen die een geschrapt exemplaar van KDM6A op het actieve chromosoom van X hebben. Deze suggestie is in lijn met de hypothese dat hoewel KDM6A x inactivering ontsnapt, zijn uitdrukking lager is van het inactieve chromosoom van X dan van het actieve chromosoom van X.25

Image of Fish Study on X chromosomen differentieel gelabeld met 5-BrdU

een afbeelding van een FISH studie toont X chromosomen differentieel gelabeld door de integratie van 5-BrdU. Het inactieve chromosoom van X (in de witte cirkel) schijnt helderder dan het actieve chromosoom van X. Xqter subtelomere sondes hybridiseren met beide X-chromosomen (blauwe pijlen). Het signaal KDM6A (witte pijl) is afwezig van het inactieve chromosoom van X en is aanwezig op het actieve chromosoom van X. Voor dit experiment werden perifere bloedlymfocyten van patiënten 1 en 2 gestimuleerd met fytohemagglutinine en gedurende 72 uur gekweekt. om het laat-replicerende inactieve X-chromosoom te identificeren, behandelden we de cellen met 5-BrdU (30 µg/ml) 5 uur voorafgaand aan de oogst. Colcemid werd vervolgens toegevoegd aan een concentratie van 0,2 µg/ml, en 1 uur later werden metafasepreparaten geproduceerd via standaardprocedures waarbij zwelling in 75 mM KCl en fixatie in 3:1 methanol/azijnzuur werden verkregen. We voerden FISH analyse door gelijktijdig met behulp van een subtelomere xqter sonde geëtiketteerd met SpectrumOrange (Vysis) aan te geven van de X chromosomen (blauwe pijl) en RP11-435K1 gelabeld met SpectrumOrange (AmpliTech) om onderscheid te maken tussen de verwijderde en niet-geëtiketteerde X chromosomen (witte pijl). Om de opsporing van opgenomen 5-BrdU te vergemakkelijken, gedenatureerden wij cellulair DNA in 2n HCl gedurende 30 min bij 37°C. 5-BrdU werd toen geëtiketteerd met een 5-BrdU-specifiek monoklonaal antilichaam vervoegd aan fluoresceïne (Roche) (1 µg/ml). Tenslotte hebben we het DNA weerlegd door een antifade oplossing aan te brengen die 0 bevat.1 µg/ml DAPI.

de rol van UTY is grotendeels onbekend en het heeft geen in vitro demethylase-activiteit. De bevinding van een mannelijk KS-individu (patiënt 3) met een intragene deletie van KDM6A en met een klinische ernst vergelijkbaar met die van patiënt 1 suggereert dat UTY het verlies van KDM6A bij mannelijke individuen gedeeltelijk zou kunnen compenseren, zoals eerder in de literatuur werd gesuggereerd.Zoals voor MLL2 zijn somatische homozygote en hemizygote mutaties in KDM6A geïdentificeerd bij verschillende soorten kanker (multipel myeloom, plaveiselcelcarcinoom in de slokdarm, niercelcarcinoom, myeloïde leukemie, borstkanker, colorectale kanker en glioblastoom), wat erop wijst dat KDM6A een tumoronderdrukkend gen is.Niettemin is kanker geen belangrijk kenmerk van KS, aangezien deze complicatie is gemeld bij slechts zeven KS-patiënten36, 37 (acute lymfoblastische leukemie, Burkitt-lymfoom, fibromyxoïdsarcoom, synoviaal sarcoom en hepatoblastoom werden eenmaal gemeld, en neuroblastoom werd gemeld bij twee KS-patiënten).35,36 als het verlies van beide allelen voldoende genoeg is om kanker te veroorzaken, zou men verwachten dat kanker vaker voorkomt in KS, zoals in retinoblastoom (MIM 180200) of Wilms tumor (MIM 194070). Dit suggereert ofwel dat verlies van het tweede allel in MLL2, KDM6A, of UTY noodzakelijk is, maar niet voldoende genoeg voor de ontwikkeling van kanker of dat deze complicatie wordt onderschat, wat het belang van natuurhistorische studies in zeldzame syndromen aantoont.37

de volgende histonmethylasen en Histon demethylasen zijn betrokken bij andere multiple-anomaliesyndromen: EHMT1 (mim 607001; Kleefstra-syndroom), SETBP1 (MIM 611060; Schinzel-Giedion-syndroom), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensen-type, X-gekoppeld mentaal-retardatie syndroom ), PHF8 (MIM 300560; Siderius-type, X-gekoppeld mentaal-retardatie syndroom), en MLL2 in KS. De identificatie van kdm6a pathogene mutaties in KS patiënten vergroot de rol van Histon-modificatiefactoren in intellectuele beperkingen en aangeboren misvormingen.

samenvattend rapporteren we mutaties van KDM6A als oorzaak van KS bij één mannetje en twee vrouwtjes. Onze bevindingen bevestigen zowel de genetische heterogeniteit van KS als een plaats op het chromosoom van X, zoals eerder is voorgesteld. Omdat sommige KS-patiënten negatief waren voor het rangschikken van MLL2, KDM6A en UTY en tijdens de screening geen deleties of duplicaties vertoonden, is het waarschijnlijk dat andere KS-geassocieerde genen nog moeten worden ontdekt.