Kinase Assay
bereid door Swathi Arur
eiwitkinase (stamoplossingen van 1-10 mg/ml zuivere kinasen) – voor deze assays gebruik ik gezuiverd erk2 kinase (NEB). Voor elk enzym, is het belangrijk om de optimale buffer, Ionische sterkte, en pH voor activiteit te bepalen. Indien deze voorwaarden niet zijn vastgesteld, kan het onderstaande protocol als uitgangspunt worden gebruikt.
substraat – stamoplossing van 10 mM) – substraten bevatten doorgaans één Serine /Threonine in een fosforyleringsmotief. Als controle gebruik ik het myeline Basic eiwit (verkregen uit Sigma), dat door NEB werd gebruikt om het erk2 kinase te calibereren.
bovendien moeten de substraten een netto positieve lading hebben om de binding aan fosfocellulosefilters die in de test worden gebruikt, te vergemakkelijken. Voor kwantitatieve binding aan het fosfocellulosepapier wordt aanbevolen om ten minste 2 basisresiduen en een vrij amino terminus te hebben. Als een phosphorylation plaatsmotief niet bekend is, kan een algemeen tyrosinekinasesubstraat worden gebruikt. Bijvoorbeeld, “myeline Basic Protein” (is een niet-specifiek substraat voor veel MAPKs). Voor initiële reacties moet een substraatconcentratie van 0,7-1,5 mM worden gebruikt. Om de kinetische parameters voor fosforylering van het synthetische peptide te bepalen, is een bereik van peptideconcentraties vereist
10X Kinasebuffer – bevat 5 mg/mL BSA (om kinaseadsorptie aan de testbuis te voorkomen), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (gekocht van Upstate Biotech-Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – een stamoplossing van 1-5 mM is handig. Merk op dat de meeste MAPKs Km-waarden voor ATP in de waaier 10-150 uM hebben, dus voor kinetische experimenten is het belangrijk om verzadigende concentraties van ATP te gebruiken om bij waarden van Km en Vmax voor peptides te komen.
ATP-10 mCi / mL.
Erk2-Kinasetests
a) AUTORADIOGRAFIETEST:
- een standaard kinasebepaling wordt uitgevoerd in een volume van 25 ul:
- 2,5 ul van 10x kinasebuffer
- 5 ul van 1,0 mM MgCl2 / ATP (0,2 mM eindconcentratie)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul van 10 mM substraat (1.2 mM eindconcentratie)
- 1 E van het ERK2-kinase
- H2O tot 25 ul
1. Bereid vóór de experimenten een cocktail voor die voldoende buffer, ATP, en ATP bevat om de analyses te voltooien. Voor tests bij verschillende substraatconcentraties moet het substraat worden verdund en afzonderlijk aan elke buis worden toegevoegd. Na toediening van de cocktail in 1,5 ml microcentrifugebuisjes, plaats de tubes in een waterbad op 30 graden C gedurende 30 minuten. Reacties moeten worden geïnitieerd door toevoeging van kinase en mogen doorgaan bij 30 graden C.
2. Na de gewenste tijd, beëindigen de reacties door 2 x SDS monsterbuffer toe te voegen en lopen op een gel.
3. Droog de gel op een Whatman 3.0-papier en stel de droge gel bloot aan een autoradiogram en houd de cassette 2 uur op-70C. (voor langere belichting moet u ervoor zorgen dat de film weer droog is voordat u een nieuw autoradiogram erop plaatst).
B) kinetische analyse:
1. Voer de kinaseanalyse zoals hierboven, dit keer gebruik verschillende concentraties van de substraten vanaf 50nM aan 1mM. Stop de reactie na 30 minuten door aan elke reactie 45 ul ijskoud 10% trichloorazijnzuur (TCA) toe te voegen. Vortex de reacties.
3. Draai 2 minuten in microcentrifuge (10K rpm).
4. Spot 35 ul van de supernatants op 2,1-cm diameter Whatman P81 cellulose fosfaat filtercirkels.
6. Was de P81 filtercirkels driemaal met 500 ml koud 0,5% fosforzuur (5-10 minuten per wasbeurt). De voortgang van de wasstappen kan worden gevolgd door het verwijderen van de P81 filtercirkel voor een blanco reactie en deze te controleren met een geigerteller.
7. Was één keer gedurende 5 minuten met 200 ml aceton op kamertemperatuur.
8. Laat de filtercirkels drogen bij kamertemperatuur.
9. Doe filtercirkels in scintillatieflacons en meet de opname van 32P door de pads droog te tellen in een scintillatieteller. De specifieke activiteit van ATP in een kinasereactie (b. v., in cpm/pmol) kan worden bepaald door een kleine steekproef (2-5 ul) van de reactie op een P81-filtercirkel te spotten en direct (geen wassen) te tellen. Tellingen per minuut verkregen in de kinasereactie (minus blanco) worden dan gedeeld door de specifieke activiteit om de Mol fosfaat overgedragen in de reactie te bepalen.
kinetiek van fosforylering van een substraat
de kinetische parameters voor fosforylering van een substraat door een MAPK kunnen worden bepaald met behulp van een variatie op het bovenstaande protocol.
1. Voer een reactie uit bij een hoge concentratie van substraat om vast te stellen dat de proteã Ne een substraat is.
2. Varieer de enzymconcentratie in de test. De fosforyleringssnelheid van het substraat moet in verhouding staan tot de enzymconcentratie onder de omstandigheden van de bepaling. Dit experiment wordt ook gebruikt om de hoeveelheid enzym te bepalen die nodig is voor de kinetische studies.
om de snelheid te bepalen, moet een tijdsverloop van substraatfosforylering worden uitgevoerd. Bereid in dit geval een grotere enzymreactie (we gebruiken 150 ul). Neem op de gewenste tijdstippen 25 ul-aliquots op en breng deze over in microcentrifugebuisjes met 45 ul ijskoude 10% TCA, en analyseer de hierboven beschreven reacties. Fosforylering van het substraat moet lineair zijn met de tijd, en voor het meten van kinetische constanten moet de beginsnelheid van de reactie (5%) worden gebruikt.
3. Varieer de substraatconcentratie in de assay. Gebruik een plot van snelheid versus peptide concentratie om een initiële schatting van de waarde van Km te krijgen. Bij deze eerste meting moet een breed scala aan substraatconcentraties (bv. 20 uM tot 2 mM) worden gebruikt.
4. Om Km (substraat) en Vmax te bepalen , varieer de substraat concentratie en meet de snelheid van fosfaatoverdracht. Een goed bereik van substraatconcentraties zijn de volgende veelvouden van Km: 0,125 x Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. De reacties moeten in drievoud worden uitgevoerd voor de beste resultaten.
5. Kinetische constanten worden bepaald door gewogen niet-lineaire kleinste kwadraten die passen bij de hyperbolische snelheid vs. plots met behulp van iteratieve programma ‘ s zoals Nfit (Island Products, Galveston, TX).
berekening van RAR:
RAR: relatieve Acceptorverhouding = Vmax / Km gedefinieerd als een algemene maat voor het vermogen van een eiwit om als substraat te functioneren.
I normaliseer de RAR van een bepaald substraat met myeline Basic Protein, d.w.z. bereken de waarde van RAR voor elk substraat en deel dit vervolgens door de waarde van RAR van myeline Basic Protein (waarbij MBP op 1,0 wordt gesteld).
