Structural basis for the recognition of K48-linked Ub chain by proteasomal receptor Rpn13

K48-linked Ub chain dynamisch fluctueert tussen meerdere conformaties

we gebruikten smFRET om de ruimtelijke ordening van de twee Ub subunits in ligand-free K48-diUb te beoordelen. Wij introduceerden fluorophores, Alexa Fluor 488 en Cy5, bij het n-eindpunt van distale Ub en het c-Eindpunt van proximale Ub (aanvullende Fig. S1a). Met behulp van verwachting maximalisatie algoritm32, kan het smFRET profiel van K48-diUb het best worden beschreven als drie overlappende FRET soorten (aanvullende Fig. S2). De high -, medium -, en low-FRET soorten zijn gecentreerd op FRET efficiëntie van 0,74, 0,57 en 0,23, met respectievelijke populaties van ~ 48, ~ 39, en ~13% (Fig. 1 bis). De FRET afstanden tussen het centrum van fluorophores worden berekend bij ~43, ~50, ~64 Å, respectievelijk. Aldus, kunnen de High-, medium -, en low-FRET species aan compacte, semi-open, en open Staten worden toegewezen die reeds voor K48-diUb bestaan.

a met fluoroforen geconjugeerd op 76 C plaats van de proximale Ub en 0 C van de distale Ub (cf. Aanvullende Fig. S1a), kan het smFRET profiel worden gemonteerd op drie overlappende FRET soorten. Tenzij anders vermeld, wordt dit paar conjugatieplaatsen gebruikt voor alle smFRET-studies met K48-diUb. De soort met hoge FRET (rood gekleurd) komt overeen met een reeds bestaande compacte toestand. b-d de compacte toestand kan selectief worden verrijkt met full-length Rpn13, en de bevolkingsgroei kan worden aangepast aan een bindende isotherm. bijvoorbeeld de compacte toestand kan selectief worden verrijkt met Rpn13NTD, en de bevolkingsgroei kan worden aangepast om een bindende isotherm te zijn. h met fluorophores die bij n25c/n25c plaatsen worden vervoegd, kan Rpn13NTD selectief de reeds bestaande compacte staat van distale diUb van K48-tetraUb verrijken (cf. Aanvullende Fig. S5), die een bindingsaffiniteit verlenen. De populaties van de smFRET-soorten zijn gemiddeld over drie onafhankelijke metingen, waarbij de fouten 1 SD aangeven; de KD-waarden worden gerapporteerd als “best fit” ± “fitting” – fouten

de conformationele fluctuatie van K48-diUb is eerder onderzocht gebruikend smFRET26. In die studie, de auteurs opgelost twee smFRET soorten voor K48-diUb, namelijk high-FRET en low-FRET soorten met Centrum FRET efficiëntie op 0,69 en 0,41, respectievelijk, naast een no-FRET soort. De auteurs toonden aan dat de titratie van een geïnactiveerde OTUB1 (OTUB1i), een deubiquitinase specifiek voor K48 isopeptide linkage33, voornamelijk de low-FRET species verrijkt. Hun observatie leidde tot het voorstel dat K48-diUb specifiek kan worden herkend door OTUB1 via een conformationeel selectiemechanisme. Hier herhaalden we de smfret titratie, en vonden dat OTUB1i verrijkt de medium-FRET species (aanvullende Fig. S3a-c). Bovendien kan de populationele toename van de medium-FRET species op otub1i titratie aan een bindende isotherm met een KD waarde van 7.7 ± 0 worden gemonteerd.1 µM (aanvullende Fig. S3d), die dicht bij de eerder gerapporteerde KD-waarde26 ligt. De gemiddelde FRET-soort in dit onderzoek moet dus overeenkomen met de soorten met lage FRET in het vorige onderzoek, en de discrepantie kan ontstaan door verschillende fotonentelling-efficiënties en passende routines van smfret-tijdssporen.

om verder te bevestigen dat K48-diUb onder drie reeds bestaande conformational Staten schommelt, introduceerden wij fluorophores bij extra paren van fluorophore vervoegingsplaatsen (aanvullende Fig. S1b-d). Voor de alternatieve locaties kunnen, hoewel de centrale efficiëntie van de FRET-soorten verschilt, de smFRET-profielen nog steeds worden beschreven als drie overlappende FRET-soorten met vergelijkbare populaties (aanvullende Fig. S4). Bijvoorbeeld, voor de 25 C / 25 C conjugatie sites, de High -, medium -, en low-FRET soorten zijn gecentreerd op FRET efficiëntie van 0,68, 0,54 en 0,21, met respectievelijke populaties van ~ 48%, ~ 43%, en ~9% (aanvullende Fig. S4d). Aldus, is de vervoeging van fluorophores onwaarschijnlijk om eiwitstructuur te verstoren, en de smFRET metingen hebben de inherente conformational dynamica van K48-diUb ongeacht de vervoegingsplaats geopenbaard, dat wil zeggen, de K48-diUb wisselt tussen drie verschillende staten in de afwezigheid van een partnerproteã ne.

om verder te beoordelen of Ub-subeenheden in langere K48-gekoppelde Ub-keten ook fluctueren tussen meerdere conformationele toestanden, analyseerden we het smFRET-profiel van K48-gekoppelde tetra-ubiquitine (K48-tetraUb). Wij vervoegden fluorophores bij twee plaatsen N25C in distal diUb (met gerespecteerd aan proximal diUb) van K48-tetraUb. Het smFRET profiel kan ook als drie overlappende FRET soorten (aanvullende Fig. S5a). Hoewel de relatieve populaties van de drie soorten verschillen van dat van een geïsoleerde K48-diUb met fluorophores vervoegden op dezelfde plaatsen (aanvullende Fig. S4d), zijn de centrale FRET efficiency van de FRET soorten bijna identiek. Zo wordt de conformationele toestand van de diub-eenheid waarschijnlijk bewaard in een langere K48-gekoppelde Ub-keten, terwijl het verschil in de relatieve populaties een gevolg kan zijn van modulerend effect van de proximale diUb.

de soort met hoge FRET wordt selectief verrijkt door Rpn13

om de relatie tussen de conformationele dynamica van K48-gekoppelde Ub-keten en rpn13-herkenning te beoordelen, titreerden we 150 pM fluorophore-gelabelde K48-diUb met menselijk volledig rpn13-eiwit. Interessant is dat bij de toevoeging van 100 nM Rpn13, de reeds bestaande high-FRET soorten van K48-diUb is verrijkt van ~ 48% tot ~ 57% (Fig. 1a, b), terwijl de populatie van middelgrote en lage FRET soorten afneemt. De populatie van hoog-FRET soorten blijft toenemen met meer Rpn13 toegevoegd (Fig. 1c), en de bindingsisotherm kan worden gemonteerd op een KD-waarde van 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

eerder is aangetoond dat Rpn13NTD voornamelijk verantwoordelijk is voor Ub-binding6,7. Aldus, voerden wij smfret titratie voor 150 pm fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb gebruikend slechts Rpn13NTD die slechts de eerste 150 residuen omvatten. Rpn13NTD verrijkt ook selectief de high-FRET soorten van K48-diUb (Fig. 1e, f). De populatiegroei van soorten met een hoge FRET kan worden aangepast om een KD-waarde van 33,1 ± 6,9 nM te kunnen veroorloven (Fig. 1g), dat is ongeveer 4-voudige toename in affiniteit in vergelijking met full-length Rpn13. Als fluorophores bij alternatieve vervoegingsplaatsen (aanvullende Fig. S1b en S4b), titratie van Rpn13NTD veroorzaakt ook de verrijking van equivalente FRET soorten volgens een soortgelijke trend, waardoor bijna identieke KD waarde (aanvullende Fig. S6). Het verschijnen van extra residuen kan dus een klein remmend effect hebben op de interactie tussen Rpn13NTD en K48-diUb.

verder voerden we smfret titratie uit voor 150 pM K48-tetraUb met fluoroforen geconjugeerd aan de distale diUb (aanvullende Fig. S5a). De titratie van Rpn13NTD verrijkt selectief de reeds bestaande hoog-LIJSTWERKSPECIES van fluorophore-geëtiketteerde distale diUb (aanvullende vijg. S5b-d), en de bindingsisotherm kan worden gemonteerd op een KD-waarde van 214 ± 70 nM (Fig. 1h). De 7-voudige reductie in bindingsaffiniteit vergeleken met Rpn13NTD:K48-diUb interactie kan worden toegeschreven aan de zelfassociatie tussen distale diUb en proximale diUb34, waardoor het bindingsoppervlak minder beschikbaar is voor rpn13 binding. Belangrijk is dat Voor alle smfret titraties van K48-diUb of K48-tetraUb, de centrale efficiëntie van de high-FRET soorten weinig verandert in de afwezigheid of aanwezigheid van Rpn13 of Rpn13NTD. Dit betekent dat Rpn13 bindt aan een reeds bestaande bouw van K48-diUb door een conformationeel selectiemechanisme, of K48-diUb zelf is of deel uitmaakt van een langere Ub-keten. Het betekent ook dat de hoog-LIJSTWERKSPECIES, d.w.z. de reeds bestaande compacte staat van K48-diUb, niet volledig gesloten is, en klaar is om met andere proteã nen in wisselwerking te staan. Belangrijk, wijst de selectieve verrijking van de hoog-FRET species er ook op dat Rpn13 met beide Ub subeenheden tegelijkertijd zou moeten interageren.

Rpn13 bindt bij voorkeur aan K48-gebonden diUb

om de bindingsspecificiteit van Rpn13 voor K48-koppeling te beoordelen, hebben we de bindingsaffiniteiten tussen Rpn13 en andere typen Ub-eiwitten beoordeeld. Met de titratie van 200 nM Rpn13NTD in 150 pM fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb, stijgt de bevolking van de hoog-LIJSTSPECIES met 15% van ~48% tot ~63% (Fig. 1f). Bij deze concentratie is de K48-diubbinding nog niet verzadigd met Rpn13NTD (Fig. 1g) en daarom is de populatie van de soorten met een hoge FRET gevoelig voor kleine veranderingen in de beschikbare Rpn13NTD-concentratie. Unlabled K48-diUb kan voor de band aan Rpn13NTD met fluorophore-geëtiketteerde K48-diUb concurreren. Met de toevoeging van 150 pM unlabeled K48-diUb, daalt de bevolking van de hoog-FRET species met 7,5%, die aan een 50% remming van rpn13ntd-gebonden fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb (Fig. 2 bis). Met de toevoeging van 300 pM zonder label K48-diUb, neemt de populatie van hoog-FRET soorten af met 11%, wat neerkomt op een totaal van 73% remming (Fig. 2b). Als zodanig, concurreren zowel fluorophore-geëtiketteerd als unlabeled K48-diUb voor de zelfde bindende interface op Rpn13 met gelijkaardige bindende affiniteit. Dit betekent ook dat de vervoeging van fluorophores aan K48-diUb weinig verstoring aan de interactie tussen Rpn13NTD en K48-diUb veroorzaakt.

A, B de toevoeging van 200 nM Rpn13NTD verrijkt eerst de hoog-LIJSTWERKSPECIES van fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb (cf. Figuur 1f), en verdere toevoeging van 150 pM en 300 pM unlabeled K48-diUb verminderen de populatie van de high-FRET soorten. C, d toevoeging van 150 pM en 300 pM unlabled Ub monomeer heeft verwaarloosbaar effect op de populatie van de high-FRET soorten. E, f toevoeging van 150 pM K48-diUb en 150 pM M1-diUb oorzaak zeer kleine daling van de populatie van de hoge-FRET soorten

voorts, aan het mengsel van 200 nM rpn13ntd en 150 pm fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb, voegden wij unlabeled Ub monomeer, K63-verbonden diubiquitin of M1-verbonden diubiquitin toe, om te beoordelen of andere types van Ub K48-diUb kunnen verdringen. De populatie van de soorten met hoge FRET verandert weinig met de toevoeging van 150 pM of 300 pM Ub monomeer (Fig. 2c, d). Met de toevoeging van 150 pM K63-diUb en 150 pM M1-diUb, is de populatie van de hoog-FRET soorten ook onveranderd binnen het foutenbereik (Fig. 2e, f). Anderzijds, veroorzaakt de directe titratie van 1 µM Rpn13NTD in fluorophore-geconjugeerde K63-diUb en M1-diUb weinig verandering aan hun reeds bestaande smfret-profielen (aanvullend Fig. S7). Samen, Rpn13NTD selectief interactie met K48-diUb.

Oplossingsstructuur van Rpn13NTD:K48-diUb complex

hoewel we nu hebben aangetoond dat Rpn13NTD selectief interageert met K48-diUb, is alleen de complexe structuur tussen Rpn13NTD en Ub monomeer bepaald 6,8. Om te begrijpen hoe de twee subeenheden in K48-diUb gelijktijdig kunnen interageren met Rpn13NTD, hebben we de oplossingsstructuur van Rpn13NTD bepaald:K48-diUb complex met behulp van nuclear magnetic resonance (NMR). Op de vorming van complexe proteã ne, zouden de interfacialresidu ‘ s verschillend lokaal milieu ervaren en daarom NMR signalen tonen. We vonden dat, titreren van niet-gelabelde K48-diUb tot 15N-gelabelde Rpn13 veroorzaakt grote chemische verschuiving verstoringen (CSP ‘ s), die voornamelijk betrekking hebben op residuen 73-83 en 93-106 (Fig. 3a). Deze residuen vormen een aaneengesloten oppervlak op Rpn13, die een groter oppervlak beslaan dan verwacht van de eerder vastgestelde complexe structuur tussen Rpn13NTD en Ub monomer6,7. Aan de andere kant worden de CSP ‘ s voornamelijk waargenomen voor residuen in het β-bladgebied van beide Ub-subeenheden, bij titratie van niet-gelabelde Rpn13NTD naar K48-dUb, met ofwel proximale of distale Ub 15N-gelabeld en de andere subeenheid niet-gelabeld. Sommige van de interfaciale residuen verdwenen ook bij de vorming van het complex (Fig. 3b, c).

A-c CSP gemiddeld meer dan 1h en 15N dimensies van backbone amide protonen op de vorming van het complex met 0.2 mM isotoop-geëtiketteerde en unlabeled proteã nen. Inzetstukken: de 15N-gelabelde subeenheid wordt geïllustreerd met oppervlakteweergave, en de rood gekleurde residuen hebben CSP ‘ s boven de stippellijn. d, e met een paramagnetische sonde geconjugeerd op de e24c plaats van de distale Ub, werden de intensiteitsverhoudingen tussen paramagnetische en diamagnetische spectra en de PRE Γ2 waarden beoordeeld voor backbone amide protonen van 15N-gelabeld Rpn13NTD. Grijze dozen duidden op residuen met zeer grote intermoleculaire PREs. f met de paramagnetische sonde geconjugeerd op n25c plaats van de proximale Ub, werden Γ2 waarden gemeten voor amide protonen van 15N-gelabeld distale Ub in K48-diUb. De foutbalken geven 1 S. D., en residu ‘ s volledig verbreed in het complex worden aangeduid met sterren

Nuclear Overhauser effect (NOE) meldt afstandsverhouding (<6 Å) tussen kernen. Bovendien kan het 13C half-gefilterde NMR-experiment NOE tussen 12C-gebonden proton en 13C-gebonden proton, d.w.z. intermoleculaire afstandsrelatie verstrekken. We verkregen intermoleculaire NOEs tussen Rpn13NTD en de proximale Ub, tussen Rpn13NTD en de distale Ub, en tussen proximale Ub en distale Ub (aanvullende Fig. S8). Verder vervoegden we een maleimide-EDTA-Mn2+ paramagnetische sonde op de e24c locatie van de distale Ub, en verzamelden we paramagnetische relaxation enhancement (PRE) voor backbone amide protonen van Rpn13NTD, volgens het vastgestelde protocol 22,35. De rpn13-residuen 30-42 en 101-106 ervaren, gemeten aan de hand van de piekintensiteitsverhouding van paramagnetische versus diamagnetische spectra of aan de hand van de transversale relaxatieversterking Γ2-snelheid, grote PREs met een ernstige lijnverbreding (Fig. 3d, e). We hebben ook de paramagnetische sonde geconjugeerd op N25C-locatie van de proximale Ub en de transversale relaxatieversterking Γ2 geëvalueerd voor de distale Ub (Fig. 3f). Grote PRE-waarden worden waargenomen tussen de twee Ub-subeenheden van de ligandvrije K48-diUb, en de toevoeging van Rpn13NTD verhoogt inter-Ub PREs maar met een vergelijkbaar PRE-profiel. De PRE NMR experimenten bevestigen dus dat Rpn13NTD de reeds bestaande compacte toestand van K48-diUb verrijkt.

om de Rpn13NTD te verfijnen:K48-diUb complexe structuur tegen experimentele beperkingen, voerden we rigide lichaam docking met torsiehoek vrijheid gegeven aan de diub linker residuen en aan de zijketens van interfaciale residuen. Voor de 20 conformers met de laagste energie bedraagt de afwijking van de wortel-gemiddelde-kwadraat (RMS) voor zware backbone-atomen van alle stijve residuen 0,86 ± 0,54 Å (aanvullende Fig. S9 en tabel S1). De twee Ub subeenheden van K48-diUb blijven geassocieerd in het complex, begraven oplosmiddel toegankelijke oppervlakte (SASA) van ~1130 Å2. Aan de andere kant, rpn13ntd wiggen in, begraven ~940 Å2 van SASA met de proximale Ub en ~1300 Å2 van SASA met de distale Ub (Fig. 4a). De complexe structuur tussen Rpn13NTD en proximale Ub van K48-diUb in deze studie is vergelijkbaar met de bekende complexe structuur tussen rpn13ntd en Ub monomer6,7, met het RMS verschil voor backbone zware atomen 2,17 ± 0,31 Å (aanvullende Fig. S10a). Interessant, hoewel de hydrofobe residuen L8, I44 en V70 in de proximale Ub betrokken zijn voor interactie met Rpn13, dezelfde drie residuen in de distale Ub zijn begraven in Ub-Ub interface.

een structuur van Rpn13NTD: K48-diUb complex. Vorming van het complex begraaft uitgebreide interfaces tussen de subeenheden. b elektrostatische potentiële oppervlakken van Rpn13NTD en distale Ub van K48-diUb, getekend op ± 3 kBT schaal. Residuen R104 in Rpn13NTD en D39 in distale Ub worden weergegeven als ballen-en-sticks. c R104E charge-reversal mutation in Rpn13NTD veroorzaakt een 300-voudige afname van de bindingsaffiniteit voor K48-diUb, zoals beoordeeld door smFRET (cf. Aanvullende Fig. S11). De KD-waarde wordt gerapporteerd als “best fit ± fitting fouten”. d Western blot analyses tonen aan dat de transfectie van rpn13 r104e mutant (met een n-terminale vlag) de totale hoeveelheid K48-gebonden polyUb eiwitten in cel verhoogt. e-cellevabilities na hitteschok (ten opzichte van cellen zonder hitteschok) tonen aan dat transfectie van rpn13 R104E-mutant, maar niet van het wildtype Rpn13, thermotolerance veroorzaakt. * P < 0,05, * * * P < 0.001, om de controle cellen in dezelfde groep, ongepaarde t-test; ##P < 0.01, ###P < 0.001, aan de onbehandelde cellen met heat shock, one-way ANOVA; &&P < 0.01, &&&P < 0.001, tot wildtype Rpn13 de getransfecteerde cellen met heat shock, one-way ANOVA

De Rpn13NTD:K48-diUb complexe structuur kan ook worden bevestigd door de single-molecule FRET gegevens. Gebaseerd op de complexe structuur, modelleerden wij fluorophores bij hun vervoegingsplaatsen in K48-diUb. De gemiddelde afstand is 43,2 ± 5.8 Å tussen de geometrische centra van fluorophore aromatische ringen, die aan een theoretische LIJSTWERKEFFICIËNTIE van 0,73 ± 0,13 (aanvullende Fig. S10b). Deze waarde is bijna hetzelfde als de centrumefficiëntie waargenomen voor de soorten met hoge FRET (Fig. 1 bis).

verstoring van Rpn13NTD: distale Ub-interactie veroorzaakt accumulatie van ubiquitinated proteïnen in cel

In de complexe structuur tussen Rpn13NTD en K48-diUb is de interactie tussen Rpn13NTD en de proximale Ub vergelijkbaar met die tussen Rpn13NTD en Ub-monomeer, zoals eerder gerapporteerd (aanvullende Fig. S10a). Zo ontwierpen we experimenten om het functionele belang voor de interactie tussen Rpn13NTD en de distale Ub van K48-diUb te beoordelen. Veel geladen residuen bevinden zich op het raakvlak tussen Rpn13NTD en de distale Ub van K48-diUb, en daarom kan elektrostatische kracht een belangrijke rol spelen voor het stabiliseren van het complex (Fig. 4b). Onder hen, residu D39 in de distale Ub is dicht bij residu R104 in Rpn13. Wij zo muteerden rpn13 residu R104 aan een glutamaat, en titreerden mutant Rpn13NTD aan fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb. Het mutant eiwit verrijkt de high-FRET soorten van K48-diUb (aanvullende Fig. S11). De bindingsaffiniteit wordt echter veel zwakker. De bindingsisotherm kan worden gemonteerd op een KD-waarde van 10,0 ± 3,3 µM, ongeveer 300 keer zwakker dan het wildtype Rpn13NTD (Fig. 4c). Als zodanig is de associatie met de distale Ub belangrijk voor de specifieke herkenning tussen Rpn13 en K48-diUb.

de verminderde bindingsaffiniteit van de r104e-mutant stelde ons in staat het functionele belang van de interactie tussen Rpn13 en K48-gekoppelde Ub-keten te beoordelen. Voorbijgaande transfectie van wildtype Rpn13 verhoogt licht de hoeveelheid K48-gebonden polyUb eiwitten (Fig. 4d). Het is mogelijk dat, na rpn13 transfectie, een overmaat aan vrije Rpn13 concurreren voor binding aan de K48-gebonden polyUb-eiwitten met proteasoom-geassocieerde rpn13, waardoor de rekrutering van ubiquitinated substraateiwitten aan het proteasoom minder efficiënt. Aan de andere kant, verhoogt de transfectie van rpn13 r104e mutant sterk de hoeveelheid K48-verbonden polyUb proteã nen, in vergelijking met de cellen transfected met wildtype Rpn13 (Fig. 4d). Als positieve controle incubeerden we de cellen met 1 µM MG132, een krachtige proteasoomremmer36. Wegens de blokkering van degradatie van labiele proteã nen, verhoogt de toevoeging van MG132 beduidend de hoeveelheid K48-verbonden polyUb proteã nen. Samen genomen, kan de verandering van R104E van Rpn13 tot de accumulatie van ubiquitinated substraatproteã nen leiden. Dit kan worden toegeschreven aan een zwakkere interactie tussen proteasoom-geassocieerde rpn13-mutant en K48-diUb en K48-poyUb.

hitteschok kan de levensvatbaarheid van de cellen verminderen. We vonden dat 30 min hitteschok bij 43 °C de levensvatbaarheid van HEK293 cellen kan verminderen tot 75%. Gelijkaardig aan de vorige rapporten36,37, vonden wij ook dat de behandeling van MG132 een beschermend effect op celoverleving op hitteschok heeft, met cellevensvatbaarheid verminderd tot ~90% (Fig. 4e). Dit komt omdat MG132 proteasomale degradatie remt, waardoor de anders kortlevende hitteschok-eiwitten meer beschikbaar zijn (Fig. 4d). We analyseerden ook de levensvatbaarheid van warmte-geschokte cellen getransfecteerd met wildtype Rpn13, en vonden geen significant verschil met de controlecellen zonder rpn13-transfectie. Aan de andere kant, de levensvatbaarheid van de cel van rpn13 r104e transfected cellen daalde tot ~83% op hitteschok, die beduidend hoger is dan die van controlecellen en cellen transfected met wildtype Rpn13 (Fig. 4e). Dit impliceert dat de mutant Rpn13 een beschermend effect heeft op de celoverleving na hitteschok, vergelijkbaar met het effect van MG132. Samen genomen, de interactie tussen Rpn13 en K48-linked Ub keten is essentieel voor Rpn13-gemedieerde opname van ubiquitinated substraat eiwitten door het proteasoom, terwijl een grensvlakken punt mutatie in Rpn13 kan leiden tot accumulatie van bepaalde ondergrond eiwitten zoals heat shock eiwitten, en geven thermotolerance de getransfecteerde cellen.

Rpn13NTD: K48-diUb interactie kan worden gericht op het moduleren van Rpn13 functie

Rpn13 wordt dynamisch gerekruteerd voor het proteasoom via de interactie tussen Rpn13NTD en de C-terminal staart van Rpn27,13. De complexe structuur Hier geeft aan dat de binding interface op Rpn13NTD voor Rpn2 is dicht bij, maar niet overlapt met de binding interface voor de distale Ub van K48-diUb (Fig. 5a). We voorgemengd dus de laatste 16 residuen van Rpn2 (Rpn2CTD) met Rpn13NTD of met full-length Rpn13 op 1:1 verhouding, en getitreerd rpn13ntd:rpn2ctd complex om fluorophore-gelabeld K48-diUb. Het voormengen van Rpn2CTD verhoogde de KD-waarde van Rpn13NTD: K48-diUb van 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g) tot 66,8 ± 13,9 nM (aanvullende Fig. S12a-c en Fig. 5b), terwijl verminderde de KD-waarde van Rpn13:K48-diUb van 119 ± 24 nM (Fig. 1d) tot 43,9 ± 12,8 nM (aanvullende Fig. S12d-f en Fig. 5c). De associatie van Rpn2CTD veroorzaakt dus slechts een kleine verstoring van de bindingsaffiniteit tussen Rpn13 en K48-diUb, wat ook te maken kan hebben met de aanwezigheid van linker en het C-terminal domein van Rpn13.

a het bindoppervlak van de distale Ub van K48-diUb op Rpn13NTD grenst aan het bindoppervlak van Rpn2CTD. Met rpn13ntd-rpn2ctd complexe structuur (PDB code 5V1Y) bovenop Rpn13NTD, Rpn2CTD wordt weergegeven als rode cartoon. Rpn13 residu K34 ligt dicht bij het c-Eindpunt van distale Ub (weergegeven als een stippellijn). B, c Binding affiniteiten werden verkregen uit smFRET titraties van equimolar Rpn13NTD: Rpn2CTD of Rpn13: Rpn2CTD fluorophore-label K48-diUb. De KD-waarden worden gerapporteerd als “best fit ± fitting fouten”. d Binding van Rpn2-verankerd Ub monomeer neemt waarschijnlijk hetzelfde bindingsoppervlak van de distale Ub, waardoor de verplaatsing van de laatste. e, f de smfret concurrentie experimenten, met verdere toevoeging van 150 pM rpn2ctd-Ub fusie-eiwit, aan het mengsel van 200 nM Rpn13NTD of full-length Rpn13 en 150 pM fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb (c.f. figuur 1c en f). De fout geeft 1 S. D. Aan uit drie onafhankelijke metingen van de populaties van de smFRET-soorten

Rpn2 en distale Ub van K48-diUb bezetten nabijgelegen oppervlakken op Rpn13NTD. Daarom kan een fusie-eiwit met Ub-monomeer toegevoegd aan het c-Eindpunt van Rpn2CTD uitsteken en interfereren met de interactie tussen Rpn13NTD en de distale Ub van K48-diUb (Fig. 5d). Zoals wij hebben getoond, verhoogt de toevoeging van 200 nM Rpn13NTD de bevolking van de hoog-LIJSTWERKSPECIES van 150 pm fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb aan ~63% (Fig. 1f), terwijl toevoeging van Ub monomeer niet kan concurreren voor rpn13ntd binding (Fig. 2c, d). Wanneer we extra 150 pM unlabeled rpn2ctd-Ub fusie-eiwit toegevoegd, de populatie van high-FRET soorten daalt met ~4% tot ~ 59% (Fig. 5e). Anderzijds, hebben wij aangetoond dat, toevoeging van 200 nM Full-length Rpn13 de bevolking van de hoog-LIJSTWERKSPECIES van 150 pM fluorophore-geëtiketteerd K48-diUb Aan ~60% (Fig. 1c). Verdere toevoeging van 150 pM niet gelabeld rpn2ctd-Ub fusie-eiwit vermindert de populatie van high-FRET soorten met ~ 4,5 tot ~ 55,5% (Fig. 5f). Merk op dat het toevoegen van een Ub op Rpn2CTD bijna geen effect heeft op de interactie tussen Rpn2CTD en Rpn13NTD (aanvullende Fig. S13). Dus, onze gegevens geven aan dat rpn2 en K48-diUb binding interfaces op Rpn13NTD zijn dicht bij elkaar. Belangrijker nog, Rpn2-verankerde Ub kan fysiek de toegang van de distale diUb naar Rpn13 blokkeren, en de interactie tussen K48-diUb en Rpn13 verzwakken.