- Abstract
- 1. Inleiding
- 2. Materialen en reagentia
- 2.1. Humane limbale epitheliale Celisolatie en kweek
- 2.2. Colony Forming Efficiency Assay (CFE)
- 2.3. Celpopulatieverdubbelingstest
- 2.4. RNA-extractie en kwantitatieve Real-Time polymerasekettingreactie
- 2.5. Immunofluorescerende kleuring
- 2.6. Western Blot analyse
- 2.7. Statistieken
- 3. Resultaten
- 3.1. Het fenotype van corneale epitheliale stamcellen in Sr Medium
- 3.2. Vervolgens onderzochten en vergeleken we de CFE van corneale epitheliale cellen gekweekt in FAD en SR media. Om de CFE te analyseren, werden de epitheliaale cellen van het hoornvlies gekweekt in SR en FAD media geoogst en gezaaid bij een dichtheid van 200 cellen per 100 mm petrischaal, die met mitomycine C-behandelde 3T3 voederlaag was voorgezaaid, en deze cultuur werd toegestaan om 12 dagen te groeien. De epitheliale cellen van het hoornvlies begonnen kolonies te vormen 5-7 dagen na kweekinitiatie. Zoals in Figuur 2(b) wordt getoond, vertonen de corneale epitheliale cellen die in SR-medium worden gehandhaafd na 12 dagen een vergelijkbare CFE-en koloniegrootte in vergelijking met cellen die in FAD-medium worden gehandhaafd. CFE-waarde voor epitheliale cellen in SR en FAD media was en, respectievelijk (Figuur 2 (c)). Statistische analyse toonde aan dat er geen significante verschillen waren in de efficiëntie van kolonievorming () en het gemiddelde gebied van de kolonies () tussen SR-en FAD-media (Figuur 2(c)). We kwantificeerden het percentage van de kolonietypes op basis van de oppervlakte van de kolonies. Uit de resultaten bleek dat het percentage mislukte kolonies (koloniegebied <1 mm2) gevormd in SR-medium gelijk was aan dat in FAD-medium (). Ook het percentage grote kolonies (koloniegebied >4 mm2) dat in SR-medium werd gevormd, lag dicht bij dat in FAD-medium () (Figuur 2(d)). Deze resultaten wijzen erop dat de epitheliaale cellen van het hoornvlies die in sr-medium worden gekweekt een gelijkaardige hogere graad van proliferative potentieel bezitten wanneer vergeleken bij cellen die in FAD-medium worden gekweekt. 3.3. PCR-en Real-Time PCR-analyse
- 3.4. Immunofluorescente kleuring
- 3.5. Western Blot
- 4. Discussie
- concurrerende belangen
- erkenningen
Abstract
de limbale epitheliale cellen kunnen worden gehandhaafd op 3T3 voederlaag met foetaal runderserum aangevuld kweekmedium, en deze cellen zijn gebruikt om limbale stamceldeficiëntie met succes te behandelen. Foetaal runderserum bevat echter Onbekende componenten en vertoont kwantitatieve en kwalitatieve variaties van lot tot lot. Om de kweekvoorwaarde te verbeteren, werd de vastgestelde vervanging van het Knockoutserum onderzocht om foetaal runderserum voor het kweken van menselijke limbale epitheliale cel te vervangen. Humane primaire limbale epitheliale cellen werden gekweekt in respectievelijk Knockoutserum en foetaal runderserum aangevuld medium. Het tarief van de celgroei, genuitdrukking, en onderhoud van limbale epitheliale stamcellen werden bestudeerd en vergeleken tussen deze twee groepen. Menselijke primaire limbale epitheliale cellen werden geïsoleerd en succesvol serieel gekweekt in dit nieuwe KnockOut serum aangevuld medium; de celproliferatie en het onderhoud van stamcellen waren vergelijkbaar met die van cellen die gekweekt werden in foetaal runderserum aangevuld medium. Deze gegevens suggereren dat dit Knockoutserum aangevuld medium een efficiënte vervanging is aan traditionele foetale runderserum aangevuld medium voor limbale epitheliale celcultuur, en dit medium heeft een groot potentieel voor langdurig onderhoud van limbale epitheliale cellen, limbale epitheliale stamcellen transplantatie, en weefselregeneratie.
1. Inleiding
corneale epitheliale stamcellen bevinden zich in de basale laag van de limbus, een gegolfde en gepigmenteerde structuur genaamd de palisades van Vogt . Deze stamcellen ondersteunen de continue vernieuwing van het cornea-epitheel gedurende een leven en vervangen gewonde of verloren cornea-epitheliale cellen . Limbale stamceldeficiëntie (LSCD) en bijbehorende oculaire oppervlakteziekten kunnen met succes worden behandeld met behulp van gekweekte limbale epitheliale autotransplantaat . Het succes van deze chirurgische behandelingen hangt af van efficiënte uitbreiding van limbale epitheliale stamcellen die 3T3 voederlaag en foetaal runderserum (FBS) in de meeste gevallen betrokken. Het 3T3-de cultuursysteem van de voederlaag werd opgezet door Rheinwald en groen en is met succes gebruikt om epitheliaale cellen van menselijke huid, haarfollikel, limbus, conjunctiva, en mondeling mucosaweefsel uit te breiden . FBS is echter niet goed gedefinieerd en vertoont altijd kwantitatieve en kwalitatieve variaties van lot tot lot . FBS bevat ook potentieel schadelijke xenogene componenten, die immunologische reacties kunnen stimuleren en dierziekten en ziekteverwekkers kunnen overdragen . Met al deze zorgen, is er een toenemende behoefte aan het ontwikkelen van goed gedefinieerde cultuurmedium ter vervanging van de traditionele FBS aangevuld medium.
Momenteel zijn er bepaalde serumvrije alternatieve media voor de groei van epitheliale cellen, zoals gedefinieerd Keratinocyt Serumvrij Medium (KSFM™, Invitrogen, USA), keratinocyt groeimedium (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) en Progenitor Cell Targeted (PCT) media (CellnTEC™, Zwitserland). Van deze producten is aangetoond dat ze de uitbreiding van corneale epitheliale cellen ondersteunen. Echter, ze hebben nog steeds supplementen van ongedefinieerde producten, zoals boviene hypofyse extract (BPE) of humaan serum albumine (HAS). En de meeste van deze media vereisen hoge cel zaaidichtheid, die niet praktisch voor uitbreiding van menselijke corneale epitheliale cellen kan zijn. Bovendien konden de epitheliale stamcellen van het hoornvlies, die als holoclones in 3T3-cultuursysteem worden ontdekt, in dit serumvrije cultuurmedium voor lange termijn niet worden gehandhaafd . Tot op heden is er geen bepaald serumvrij medium dat uitbreiding van corneale epitheliale stamcellen op lange termijn zou kunnen ondersteunen.
KnockOut serum replacement (SR) is een gedefinieerde serumvrije formulering die is ontworpen om FBS direct te vervangen voor het onderhoud van embryonale stamcellen (ESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Men heeft aangetoond dat KnockOut SR consistente de groeivoorwaarden voor de cel en IPSC cultuur van ES verstrekt, en de cellen van ES die in Knockout SR aangevuld medium worden gekweekt wezenlijk minder worden gedifferentieerd dan die die in FBS aangevuld medium worden gekweekt, en de kiemlijntransmissie wordt niet gecompromitteerd in het minst. Gezien de gelijkenissen in de cultuurmethoden van epitheliale cellen en cellen van ES, en in het licht van het feit van KnockOut SR die FBS in de celcultuur van ES vervangen, wordt hier verondersteld dat KnockOut SR zou kunnen worden gebruikt om FBS in limbale epitheliale celcultuur te vervangen.
2. Materialen en reagentia
celcultuurschalen, kolven, centrifugebuizen en serologische pipetten werden gekocht bij Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco ’s Modified Eagle’ S Medium( DMEM), Ham ‘ S F-12, HEPES, penicilline en streptomycine, L-glutamine, 0,05% trypsine-0.02% EDTA-oplossing, Superscript III-kit en RNeasy™-kit werden gekocht van Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Foetaal runderserum (FBS) werd gekocht bij Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Mouse NIH 3T3 fibroblasten (ATCC CCL 92) werden verkregen uit de American Type Culture Collection (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II was van Roche. Monoklonaal antilichaam (mAb) tegen ABCG2 (kloon BXP-21) en connexin 43 waren van Millipore; p63 (kloon 4A4), K5 en K19 kwamen van Santa Cruz; K3 mAb (kloon AE5) was van LIW Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-geconjugeerd geiten anti-muis secundair antilichaam was afkomstig van Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR en Taqman Universal PCR Master Mix AmpErase UNG kits waren afkomstig van Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycine C, runderinsuline, humane transferrine, hydrocortison, humane epidermale groeifactor (EGF), choleratoxine en andere reagentia waren afkomstig van Sigma-Aldrich (St.Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Humane limbale epitheliale Celisolatie en kweek
Cornea-limbale ringen werden geoogst van vijf gezonde donoren vlak na corneatransplantatie, informed consent werd gevraagd, en het monster oogst protocol werd goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB) van Jilin University. Verse hoornvlies-limbale ringen werden behandeld met 0,25% Dispase II bij 4°C ‘ s nachts, en epitheliale laag werd geschrobd van het onderliggende stromaweefsel en behandeld met 0,05% trypsine-0,02% EDTA bij 37°C gedurende 15 minuten. Trypsine activiteit werd geneutraliseerd door 10% FBS en dissociated limbale epitheliale cellen werden verzameld en gecentrifugeerd bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. De levensvatbaarheid van de epitheliale cellen werd bepaald door trypan blue met uitzondering van kleuring en het aantal cellen werd geteld met behulp van de hemocytometer.
muis 3T3 fibroblasten werden gehandhaafd in Dulbecco ’s Modified Eagle’ S Medium (dmem, hoge glucose) aangevuld met 10% FBS, L-glutamine (2 mM) en penicilline-streptomycine (50 IU/mL) en gekweekt met 5% CO2 en bevochtigde atmosfeer. 3T3 cellen werden om de 6 dagen gesubcultureerd bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing. 3T3 cellen werden serieel gehandhaafd, en alleen cellen vóór passage 20 werden gebruikt voor de voorbereiding van feederlaag. Om de voederlaag te bereiden, werden confluente 3T3-cellen gedurende 2 uur bij 37°C behandeld met mitomycine C (10 µg/mL), tweemaal gewassen met PBS en gedurende 5 minuten bij 37°C behandeld met 0,05% trypsine.
Humane limbale epitheliale cellen werden gekweekt op 3T3 feederlaag met behulp van FAD medium of serum replacement (SR) medium. Het fad-medium is een mengsel van DMEM en Ham ‘ S F-12-medium (1 : 1) met 10% foetaal runderserum, L-glutamine (2 mM) en penicilline-streptomycine (50 IU/mL), epidermale groeifactor (10 ng/mL), insuline (5 µg/mL), adenine (0,18 mM), hydrocortison (0,4 µg/mL), choleratoxine (0,1 nM) en triiodothyronine (2 nM). Het SR-medium is een mengsel van DMEM en Ham ‘ S F-12-medium (1 : 1) met 10% KnockOut SR-serumvervanging, L-glutamine (2 mM) en penicilline-streptomycine (50 IU/mL), epidermale groeifactor (10 ng/mL), insuline (5 µg/mL), adenine (0,18 mM), hydrocortison (0.4 µg / mL), choleratoxine (0,1 nM), trijoodthyronine (2 nM), transferrine (5 µg/mL) en selenium (5 ng/mL). Limbale epitheliaale cellen werden gezaaid op 3T3 feeder laag bij een dichtheid van 6.000 cellen / cm2 en gekweekt met 5% CO2 en bevochtigde atmosfeer. Het FAD-medium werd om de 3 dagen gewijzigd, terwijl het SR-medium om de 2 dagen werd gewijzigd.
2.2. Colony Forming Efficiency Assay (CFE)
voor de CFE-assay werden 200 humane limbale epitheliale cellen uit FAD-cultuur of SR-cultuur geplateerd op een 100 mm petrischaal met met mitomycine C behandelde 3T3-voederlaag en gekweekt zoals hierboven beschreven. Na 12-daagse cultuur werden de gerechten 30 minuten lang bij kamertemperatuur met 10% formaline gefixeerd en nog eens 30 minuten lang met 1% Rhodamine B gekleurd. Na het wassen met gedestilleerd water werden de Kolonien geteld en geanalyseerd. De kolonievormingsefficiëntie werd uitgedrukt als het aantal gevormde kolonies gedeeld door 200.
2.3. Celpopulatieverdubbelingstest
limbale epitheliale cellen werden gehandhaafd op met mitomycine C behandelde 3T3-feederlaag met behulp van FAD-medium of SR-medium. Epitheliaale cellen werden trypsinized wanneer het bereiken van 80-90% samenvloeiing en passaged bij een dichtheid van 6.000 cellen/cm2. Culturen werden achtereenvolgens onderhouden gedurende 10 passages. Bij elke passage werden limbale epitheliale cellen geoogst en werden celaantallen geteld. Het aantal populatieverdubbelingen (PD) voor elke passage werd berekend volgens de volgende formule: , waarbij het totale aantal cellen is dat bij elke passage is verkregen en het aantal platingcellen aan het begin.
2.4. RNA-extractie en kwantitatieve Real-Time polymerasekettingreactie
om het genexpressieniveau van limbale epitheliale cellen te evalueren, werden PCR en real-time PCR uitgevoerd. Totaal RNA werd gehaald uit de cornea epitheliale cellen met behulp van de RNeasy kit volgens de instructies van de fabrikant. RNA werd gekwantificeerd door zijn absorptie bij 260 nm en opgeslagen bij -80°C. Om cDNAs samen te stellen, werd 1 µg van totaal RNA gebruikt met de uitrusting van de Superscript III omgekeerde transcriptie. PCR werd uitgevoerd gebruikend Platinum PCR master mix( Het Leven Technologie); en real-time PCR werd uitgevoerd gebruikend SYBR Green PCR Master Mix (Roche) met de eerder beschreven primers . Realtime PCR-reacties werden in drievoud uitgevoerd met een eerste activeringsstap bij 95°C gedurende 3 minuten, gevolgd door 45 cycli: 95°C gedurende 30 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72°C gedurende 40 seconden. De relatieve genexpressie werd berekend door het verschil in cyclusdrempel (delta Ct), waarden van de genen te normaliseren tot de delta Ct-waarde van glyceraldehyden-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH).
2.5. Immunofluorescerende kleuring
Humane limbale epitheliale cellen werden gezaaid in kweekdia met 3T3-feederlaag in FAD-medium of SR-medium. Drie dagen na het zaaien werden de culturen gedurende 10 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde of koude aceton bij 4°C. Na tweemaal wassen met PBS werden de cellen gedurende 30 minuten Geblokkeerd met 5% geitenserum in PBS. De primaire antilichamen van de muis tegen p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore) en connexin 43 (1: 1000, Millipore) werden aangebracht en ‘ s nachts bij 4°C geïncubeerd. De celkernen werden vervolgens gedurende 20 minuten met Hoechst 33342 (1 µg/mL in PBS) tegengewerkt. Na 3 keer wassen met PBS werd de celcultuur gemonteerd met montagemiddel (Vectorlaboratoria, Burlingame, CA) en onderzocht onder een fluorescerende microscoop (BX50).; Olympus, Tokio, Japan).
2.6. Western Blot analyse
gekweekte limbale epitheliale cellen werden gedurende 30 minuten gelyseerd met RIPA buffer (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% natriumdeoxycholaat, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA en proteaseremmercocktail; Roche diagnostiek) op ijs. De eiwitconcentratie werd gekwantificeerd met behulp van bicinchoninezuur (BCA) – eiwittest (Pierce, Rockford, IL). Totaal cel lysates (40 µg) waren electrophoresed in 12% van de gradiënt SDS-PAGE gel, overgedragen aan nitrocellulose membraan (Bio-Rad), geblokkeerd met 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor 1 uur, en in hoeverre met de muis antilichamen tegen woekerende cel kern antigeen (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (bxp serie-21, Millipore), of p63 (4A4, Santa Cruz, CA) en overnachting in het 4°C. De membranen waren dan weer drie keer met TBS, geïncubeerd met geit anti-muis IgG (1 : 5000, HRP-geconjugeerd, Santa Cruz, CA) of konijn anti-geit-IgG (1 : 5000, HRP-geconjugeerd, Santa Cruz, CA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, en ontwikkeld met verbeterde chemiluminescente substraten (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). De expressieniveaus van ABCG2, PCNA en p63 werden gemeten met behulp van semiquantatieve Intensiteitsmeting en genormaliseerd tot GAPDH-niveau dat diende als interne controle.
2.7. Statistieken
samenvatting van gegevens van CFE en relatieve vouw van real-time PCR werd gerapporteerd als gemiddelden ± SD en vergeleken met behulp van de niet-gekoppelde test van de Student met Microsoft Excel (2003/XP-versie). Testresultaten werden gerapporteerd als tweestaartwaarden, waar statistisch significant werd geacht.
3. Resultaten
3.1. Het fenotype van corneale epitheliale stamcellen in Sr Medium
in totaal werden 5 cornea-limbale ringweefsels geoogst van donoren in de leeftijdscategorie van 32-65 jaar. Deze weefsels werden binnen 24 uur na de oogst bewaard en verwerkt. Menselijke primaire corneale epitheliale celcultuur werd met succes opgezet in FAD-medium(figuren 1(A) en 1 (b)) en SR-medium(figuren 1(c) en 1 (d)). De corneale epitheliale cellen die in sr medium + 3T3 feeder laag gehandhaafd werden, vertoonden een morfologie met kleine afmetingen en hoge kernen/cytoplasma ratio, wat typische ongedifferentieerde epitheliale cellen morfologie was, en de grote differentiërende platte plaveiselachtige cellen werden zelden waargenomen (figuur 1(c)). De epitheelcellen die in sr-medium worden gehandhaafd, begonnen 3 dagen na het zaaien kolonies te vormen (figuur 1(c)). De grootte van deze kolonies was vergelijkbaar met die gevormd binnen fad medium + 3T3 feeder laag (figuur 1(A)), maar deze kolonies waren minder dicht verdicht dan die in FAD + 3T3 feeder laag. Binnen 7 dagen bereikten epitheliale cellen samenvloeiing in sr medium met uniforme kleine grootte (figuur 1 (d)), wat ook werd waargenomen in FAD cultuur (figuur 1(b)). In deze studie, menselijke corneale epitheliale cellen kunnen worden afgeleid en gehandhaafd in sr medium + 3T3 feeder laag voor alle vijf donoren. Voor de lange termijn teelt werden menselijke cornea epitheliale cellen serieel gesubcultureerd in sr medium + 3T3 feeder laag voor meer dan 10 passages (). Tijdens elke passage, werden de cellen trypsinized en verzameld wanneer de cellen 80-90% samenvloeiing bereikten; de celaantallen werden berekend voor populatieverdubbeling assay. Het resultaat toont aan dat de epitheliaale celopbrengst van SR-medium dicht bij dat van cellen in FAD-medium is gekweekt, zoals getoond in Figuur 2(a), en deze gegevens zijn gelijkaardig aan vorige rapporten . Samengevat tonen de hier gepresenteerde gegevens aan dat SR-kweekmedium + mitomycine C-behandelde 3T3-voederlaag de klonale groei en proliferatie van menselijke corneale epitheliale cellen ondersteunt.
(een)
(b)
(c)
d)
(a)
b)
(c)
d)
(een)
(b)
(c)
d)
(a)
b)
(c)
d)
3.2. Vervolgens onderzochten en vergeleken we de CFE van corneale epitheliale cellen gekweekt in FAD en SR media. Om de CFE te analyseren, werden de epitheliaale cellen van het hoornvlies gekweekt in SR en FAD media geoogst en gezaaid bij een dichtheid van 200 cellen per 100 mm petrischaal, die met mitomycine C-behandelde 3T3 voederlaag was voorgezaaid, en deze cultuur werd toegestaan om 12 dagen te groeien. De epitheliale cellen van het hoornvlies begonnen kolonies te vormen 5-7 dagen na kweekinitiatie. Zoals in Figuur 2(b) wordt getoond, vertonen de corneale epitheliale cellen die in SR-medium worden gehandhaafd na 12 dagen een vergelijkbare CFE-en koloniegrootte in vergelijking met cellen die in FAD-medium worden gehandhaafd. CFE-waarde voor epitheliale cellen in SR en FAD media was en, respectievelijk (Figuur 2 (c)). Statistische analyse toonde aan dat er geen significante verschillen waren in de efficiëntie van kolonievorming () en het gemiddelde gebied van de kolonies () tussen SR-en FAD-media (Figuur 2(c)). We kwantificeerden het percentage van de kolonietypes op basis van de oppervlakte van de kolonies. Uit de resultaten bleek dat het percentage mislukte kolonies (koloniegebied <1 mm2) gevormd in SR-medium gelijk was aan dat in FAD-medium (). Ook het percentage grote kolonies (koloniegebied >4 mm2) dat in SR-medium werd gevormd, lag dicht bij dat in FAD-medium () (Figuur 2(d)). Deze resultaten wijzen erop dat de epitheliaale cellen van het hoornvlies die in sr-medium worden gekweekt een gelijkaardige hogere graad van proliferative potentieel bezitten wanneer vergeleken bij cellen die in FAD-medium worden gekweekt.
3.3. PCR-en Real-Time PCR-analyse
om de genexpressie te bestuderen, werden PCR en real-time PCR uitgevoerd op epitheliale cellen gekweekt in zowel FAD-als SR-media. Het huishoudgen GAPDH werd gebruikt als interne controle. PCR-gegevens tonen aan dat de cel gekweekt in zowel FAD-medium als SR-medium transcript-expressie op hoog niveau van proliferatieve teller PCNA toont. De cellen in beide media tonen positieve uitdrukking van cytokeratin 3 en cytokeratin 12, die met hun limbusoorsprong consistent is. De positieve expressie van basale laag epitheliale cel marker, cytokeratine 15, werd ook waargenomen in beide culturen. De abcg2-en ΔNp63α-expressie werden in beide culturen gedetecteerd, hoewel de abcg2-expressie na de primaire cultuur in het SR-medium iets afnam. Het lage niveau van connexin 43-expressie werd waargenomen in beide culturen en impliceerde een laag niveau van epitheliale celdifferentiatie in beide media. Voor real-time PCR toonde kwantitatieve analyse van het mRNA-niveau aan dat er geen significant expressieverschil () van p63 en ABCG2 was tussen epitheliale cellen gekweekt in FAD en SR media (Figuur 4(A)). Real-time analyse van de cornea epitheliale differentiatie marker cytokeratin 3 en cytokeratin 12 werd ook uitgevoerd. Beide van deze twee tellers waren nauwelijks detecteerbaar in zowel FAD als SR celculturen, en, verrassend, is er geen significant verschil () in uitdrukkingsniveau tussen deze twee culturen.
3.4. Immunofluorescente kleuring
om te bevestigen dat de epitheliale cellen gekweekt in sr-medium de stamheid en ongedifferentieerde toestand behielden, werd immunofluorescente kleuring van verschillende proliferatie, differentiatie en vermeende epitheliale stamcelmarkers uitgevoerd. Zoals getoond in Figuur 4, in sr-medium, toonden de meeste epitheliaale cellen een kleine en uniforme morfologie, en de meeste cellen werden sterk bevlekt met p63, de vermeende epitheliaale stamcelteller. ABCG2 positief bevlekte cellen werden ook waargenomen in een fragmentarische distributie binnen de limbale epitheliale celkolonies. De cellen in sr-medium werden zwak gekleurd voor connexin 43 en cytokeratin 3. De lage uitdrukking van deze twee differentiatietellers stelt lage niveau van epitheliaale celdifferentiatie in de celcultuur voor. De soortgelijke kleuring stijl werd ook waargenomen in cellen gehandhaafd met fad medium(Figuur 4 (b)). Deze gegevens impliceren dat menselijke limbale epitheliaale cellen gekweekt in sr medium op hoog niveau uitdrukking van vermeende epitheliaale stamceltellers gehandhaafd, terwijl het uitdrukken van laag niveau van differentiatietellers.
3.5. Western Blot
om de kwantitatieve genexpressie en immunofluorescerende kleuringsresultaten te bevestigen, werd de expressie van potentiële epitheliale stamcelmarkers (p63 en ABCG2) en proliferatiemarker (PCNA) geëvalueerd met western blot. Met behulp van monoklonaal P63-antilichaam (kloon 4A4, Santa Cruz) werd het P63-eiwit (70 KD, ΔNα-isovorm) gedetecteerd op hoog expressieniveau in SR-medium. De uitdrukking van ABCG2 (70 KD) werd ontdekt in elke passage van cellen gekweekt in sr-medium. PCNA, proliferatiemarker, werd ook gedetecteerd in cellen gekweekt in SR-medium (Figuur 3(c)). En de expressieniveaus van p63, ABCG2 en PCNA waren vergelijkbaar in 10 passages met semiquantatieve Intensiteitsmeting (Figuur 3(d)) met behulp van GAPDH als interne controle.
(een)
(b)
(c)
d)
(a)
b)
(c)
d)
(een)
(b)
(a)
(b)
4. Discussie
epitheliale cellen gekweekt op 3T3 feederlaag zijn met succes afgeleid en gebruikt voor de behandeling van verschillende klinische situaties, zoals ernstige brandwonden, diabetische voetzweren, huidafwijkingen en mondslijmvliesafwijkingen . De eerste transplantatie van limbale epitheliale stamcellen werd in 1997 beschreven door Pellegrini et al. . Gedurende de afgelopen decennia, zijn verscheidene verschillende cultuurmethodes ontwikkeld, met inbegrip van cultuur van limbale epitheliaale cellen op menselijk amnionmembraan (HAM) met of zonder 3T3 voederlaag , cultuur van epitheliaale cellen op temperatuur-responsieve platen , en cultuur van epitheliaale cellen met commercieel serum-vrij cultuurmedium. Aangezien recent rapport aangeeft dat de klinische uitkomst van cornea/limbus epitheliale cellen transplantatie afhangt van de vraag of de limbale stamcellen in de celkweek worden bewaard, werd erop gewezen dat holoclonen alleen in het fad + 3T3 kweeksysteem werden behouden . Aangezien dit kweekprotocol het gebruik van FBS impliceert, bestaat er een groeiende bezorgdheid over de veiligheid dat FBS slecht gedefinieerde dierlijke producten is en een potentieel heeft om van dieren afgeleide ziekten aan patiënten over te dragen . Daarom is er steeds meer behoefte aan het ontwikkelen van dierproductvrij en FBS-vrij kweekmedium ter vervanging van het traditionele FAD-medium .
in deze studie ontwikkelden we een nieuw serumvrij kweekmedium, waarin KnockOut SR FBS verving. De fenotypen van limbale epitheliale stamcellen in dit nieuwe serumvrije kweekmedium werden geëvalueerd door immunostaining met antilichamen voor voorgestelde stamcelmarkers (p63, ABCG2) en differentiatiemarkers (cytokeratine 3, connexin 43).
de nucleaire transcript factor p63 werd eerder voorgesteld als een marker van epitheliale stamcellen, en ΔNα is de overheersende isovorm van p63 isovormen in deze cellen . Onze resultaten komen overeen met deze eerdere rapporten; kernp63 werd sterk uitgedrukt in limbale celcultuur, die door immunostaining, real-time PCR, en westelijke vlek werd getoond. De aanwezigheid van p63 in limbale celcultuur wijst op hun hoge proliferatieve en zelf-vernieuwing potentieel. ABCG2, een lid van de de bandcassette (ABC) transporters van ATP, oorspronkelijk als bestand proteã ne 1 van borstkanker wordt bekend (BCRP1), is voorgesteld als een andere veronderstelde teller van de stamcel voor volwassen stamcellen, met inbegrip van limbus epithelial stamcellen . De hoge expressie van ABCG2 in het SR-medium werd aangetoond door immunostaining en real-time PCR.
K3 en K12 zijn bekend als corneale specifieke markers . Consistent, toonden onze immunostaining en real-time PCR resultaten aan dat de cellen K3 en K12 negatief waren, bevestigend hun limbus oorsprong. Connexin 43 is een lid van de proteã NEN familie van de gap junction; het staat directe verspreiding van laag molecuulgewichtoplossingen tussen naburige cellen toe. Connexin 43 werd gemeld om door gedifferentieerde epitheliaale cellen te worden uitgedrukt, en de afwezigheid van deze intercellulaire communicatiemoleculen kan een eigenschap van epitheliaale stamcellen zijn.
in onze resultaten drukt een groter percentage cellen p63 en ABCG2 uit, terwijl weinig cellen differentiatiemarkers K3/K12 en CX43 uitdrukken. Aldus vertoonden de menselijke limbale epitheliale stamcellen in sr serum-vrij medium gelijkaardige fenotypes en handhaven ongedifferentieerde voorwaarden, vergeleken met FBS-medium.
kortom, met behulp van KnockOut SR ter vervanging van FBS, handhaaft ons nieuwe serumvrije medium de groei en proliferatie van menselijke corneale epitheliale cellen en behoudt het epitheliale stamcellen in hun ongedifferentieerde fenotype. Deze nieuwe serumvrije kweekmethode is supplement-gedefinieerd en relatief eenvoudig te controleren. Het heeft een groot potentieel om te worden gebruikt in de transplantatie van epitheliale cellen van de kliniek en weefselregeneratie.
concurrerende belangen
de auteurs verklaren geen concurrerende belangen te hebben.
erkenningen
dit werk werd ondersteund door subsidie van de Jilin University en de National Natural Science Foundation of China (nsfc 30500548).
