zuivering en karakterisering van Asparaginase uit Phaseolus vulgaris-zaden

Abstract

L-asparaginase uit bacteriën is gebruikt bij de behandeling van acute lymfoblastische leukemie. Het doel van deze studie was het zuiveren en karakteriseren van L-asparaginase uit Phaseolus vulgaris zaden in plaats van microbiële bronnen. L-asparaginase werd gezuiverd tot schijnbare homogeniteit. Het enzym heeft een molecuulmassa van 79 kDa. De gezuiverde asparaginase had een zeer lage activiteit in de richting van een aantal asparagine-en glutamineanalogen. L-asparaginase was vrij van glutaminaseactiviteit. Kinetische parameters, Km en Vmax van gezuiverd enzym, bleken respectievelijk 6,72 mM en 0,16 µM te zijn. Het enzym had een optimale pH bij 8,0. Het enzym vertoonde een hoge stabiliteit bij alkalische pH (pH 7,5–9,0) wanneer het tot 24 uur werd geïncubeerd. L-asparaginase had dezelfde optimale temperatuur en thermische stabiliteit bij 37°C. K+ kon de activiteit van asparaginase aanzienlijk verbeteren met 150% in vergelijking met andere geteste metalen. Kortom, L-asparaginase vertoonde geen glutaminaseactiviteit en goede stabiliteit over een breed scala aan fysiologische aandoeningen, en dus kon het worden gebruikt als een potentiële kandidaat voor de behandeling van acute lymfoblastische leukemie.

1. Inleiding

L-asparaginase (l-asparagine amidohydrolase E. C. 3.5.1.1) wordt gebruikt bij de behandeling van acute lymfoblastische leukemie en non-Hodgkinlymfoom . Het gebruik van L-asparaginase bij behandeling tegen kanker is gebaseerd op zijn vermogen om L-asparagine, een aminozuur dat essentieel is voor de groei van lymfoblasten, te splitsen in ammoniak en L-asparaginezuur in serum en cerebrospinale vloeistof, omdat lymfoblasten niet in staat zijn endogeen l-asparagine te produceren, wat leidt tot de dood van deze cellen . De meeste kankercellen zijn afhankelijk van een exogene bron van dit aminozuur voor overleving. Nochtans, kunnen de normale cellen l-asparagine samenstellen en zo minder door zijn snelle uitputting toe te schrijven aan behandeling met dit enzym worden beà nvloed. L-asparaginase kan ook worden gebruikt om de vorming van acrylamide in gebakken en in de oven gekookt voedsel te verminderen, vooral in chips . De vorming van acrylamide werd toegeschreven aan de reactie van vrije asparagine en reducerende suikers . De depletie van asparagine door asparaginase verhinderde de vorming van acrylamide .

L-asparaginase is wijd verspreid onder planten, dieren en micro-organismen . In planten werd dit enzym voor het eerst gedetecteerd in de zich ontwikkelende zaden van Lupinus albus . Asparaginase is ook gezuiverd uit de testa van rijpende zaden van L. polyphyllus . Twee vormen van het enzym zijn geïdentificeerd. Een K+-onafhankelijke vorm wordt gevonden in L. arboreus en L. polyphyllus en een K+-afhankelijke vorm wordt gevonden in Pisum sativum en verschillende andere peulvruchten, waaronder andere Lupinus soorten . Werk met antilichamen tegen de k+-onafhankelijke vorm van L. polyphyllus bracht geen kruisreactie aan het licht met pea asparaginase of met een aantal Lupinus-variëteiten die het K+-afhankelijke enzym bevatten, wat erop wijst dat de twee vormen van asparaginase immunologisch verschillend zijn .

er is zeer weinig informatie gerapporteerd over het gebruik van plant asparaginase bij de behandeling van acute lymfoblastische leukemie . Daarom was het belangrijkste doel van deze studie om L-asparaginase te zuiveren en te karakteriseren uit Phaseolus vulgaris-zaden die vrij zijn van L-glutaminase in plaats van L-asparaginase uit microbiële bronnen die als antikankermiddel worden gebruikt en bijwerkingen veroorzaken vanwege de immunologische reacties.

2. Materiaal en methoden

2.1. Plantaardig materiaal

rijpe zaden van Phaseolus vulgaris cv. Gizeh 6 werden verkregen van het Agricultural Research Centre, Caïro, Egypte.

2.2. Zuivering van Asparaginase

2.2.1. Ruw Extract

het ruwe extract van asparaginase werd bereid door homogenisatie van 50 g zaden van Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0 met 10% glycerol, 50 mM KCl, 12,5 mM β-mercaptoethanol en 1 mM PMSF. Het homogenaat werd gecentrifugeerd bij 10.000 ×g en het supernatant werd aangeduid als ruw extract. Het ruwe extract werd door dialyse geconcentreerd tegen vaste sucrose.

2.2.2. Deae-Sefarosekolom

geconcentreerd ruw extract werd aangebracht op een DEAE-Sefarosekolom (15 × 1,6 cm i.d.), die voorheen werd geëquilibreerd met een Tris-HCl-buffer van 20 mM, pH 8,0. Het enzym werd geëlueerd door verschillende concentraties KCl bereid in dezelfde buffer met een stroomsnelheid van 60 mL/uur en 3 ml fracties werden verzameld. Drie eiwitpieken werden geëlueerd met asparaginase-activiteit volgens de elutieorde (asparaginases I, II en III).

2.2.3. Sephacryl S-200

Asparaginase I met de hoogste activiteit werd aangebracht op een sephacryl s-200-kolom (90 × 0.6 cm i. d.) die eerder met dezelfde buffer in evenwicht was gebracht bij een debiet van 30 mL/uur en 3 ml fracties werden verzameld.

2.3. Asparaginasebepaling

de activiteit van L-asparaginase werd gemeten met de aangepaste methode van Wriston . De L-asparaginase katalyseert L-asparagine tot L-asparaginezuur en ammoniak en deze laatste reageren met het reagens van Nessler om een oranje gekleurd product te produceren. Het enzyme assay mengsel bestond uit 900 µL vers bereid l-asparagine (20 mM) in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8,0), 50 mM KCl, en 100 µL ruw extract van het enzym. Het reactiemengsel werd 30 minuten bij 37°C geïncubeerd en de reactie werd gestopt door 100 µL 15% trichloorazijnzuur toe te voegen. Het reactiemengsel werd gedurende 5 minuten bij 4°C bij 10.000 ×g gecentrifugeerd om de neerslag te verwijderen. De ammoniak die vrijkomt in het supernatans werd bepaald met colorimetrische techniek door 100 µL Nessler ‘ s reagens toe te voegen aan het monster dat 100 µL supernatant en 800 µL gedestilleerd water bevat. De inhoud van het monster werd vortexed en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en OD werd gemeten bij 425 nm. De ammoniak die in de reactie werd geproduceerd, werd bepaald op basis van de standaardkromme die met ammoniumsulfaat werd verkregen. Eén eenheid activiteit van L-asparaginase wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 1 µmol ammoniak per min vrijmaakt bij 37°C.

2,4. Eiwitbepaling

eiwit werd gekwantificeerd volgens de methode van Bradford met standaard runderserumalbumine.

2.5. Bepaling van het molecuulgewicht

het oorspronkelijke molecuulgewicht werd bepaald met Sephacryl S-200. De kolom werd gekalibreerd met cytochroom C (12.400), koolzuuranhydrase (29.000), runderserumalbumine (67.000), alcoholdehydrogenase (150.000) en β-amylase (200.000). Dextran blue (2.000.000) werd gebruikt om het void volume (Vo) te bepalen. Het molecuulgewicht van de subeenheid werd geschat door SDS-polyacrylamidegelelektroforese . SDS-gedenatureerde fosforylase b (94.000), runderserumalbumine (67.000), ovalbumine (43.000), koolzuuranhydrase (30.000), soja-trypsineremmer (20.000) en α-lactalbumine (14.200) werden gebruikt voor de kalibratiecurve.

2.6. Karakterisering van Asparaginase

2.6.1. Substraatspecificiteit

de activiteit van Asparaginase werd bepaald met enkele analogen van L-asparagine. De relatieve activiteit werd uitgedrukt als de procentuele verhouding van de enzymactiviteit bepaald tegen verschillende structuuranalogen van L-asparagine tot enzymactiviteit met L-asparagine.

2.6.2. Kinetische Parameters

de waarden van Michaelis-constanten (Km) en maximumsnelheid (Vmax) werden bepaald met L-asparagine als substraat in het bereik van 2-20 mM. kinetische parameters werden bepaald op basis van lineweaver-Burk-plot.

2.6.3. Effect van pH

de optimale pH voor de activiteit van asparaginase werd bepaald door de activiteit bij verschillende pH-waarden te testen. De pH-stabiliteit werd getest door incubatie van het enzym bij een pH van 5,0–9,0 gedurende 24 uur bij 4°C in afwezigheid van substraat en de resterende activiteit werd bepaald onder de standaard testomstandigheden.

2.6.4. Effect van temperatuur

de optimale temperatuur voor de activiteit van asparaginase werd bepaald door het enzym bij verschillende temperaturen te testen. De hittestabiliteit werd gemeten door het enzym alleen bij verschillende temperaturen gedurende 1 uur te incuberen. na de warmtebehandeling werd de enzymoplossing afgekoeld en werd de restactiviteit na toevoeging van de substraten bepaald.

2.6.5. Metaalioneneffect

de effecten van verschillende metaalionen op de enzymactiviteit werden bepaald door het enzym alleen 15 minuten te pre-induceren met 10 mM metaalionen voordat het substraat werd toegevoegd. Bij afwezigheid van metaalionen werd 100% van de activiteit gemeten.

3. Resultaten en discussie

de resultaten van de zuiveringsstappen van asparaginase van P. vulgaris zijn samengevat in Tabel 1. Het elutieprofiel van de chromatografie op deae-Sefarose-kolom (figuur 1) toonde drie pieken van eiwitten met asparaginase-activiteit. Piek 1 met de hoogste asparaginase-activiteit werd toegepast op een Sephacryl s-200-kolom (Figuur 2). L-asparaginase I werd 21,7 maal gezuiverd met een specifieke activiteit van 846 eenheden/mg eiwit. De asparaginase I bleek zuiver te zijn na de Sephacryl s-200-kolom, zoals beoordeeld door SDS-PAGE (Figuur 3). Het molecuulgewicht van asparaginase I door sephacryl s-200-en SDS-PAGE-procedures leverde een waarde op van 79 kDa als monomeersubeenheid. Deze bevinding is in overeenstemming met het molecuulgewicht voor asparaginases van Vigna unguiculata (70 kDa) en Lupinus polyphyllus (75 kDa) . Een gemiddeld molecuulgewicht van 58 kDa werd gedetecteerd voor asparaginase uit erwtenbladeren . Voor bacteriële asparaginases varieerde het molecuulgewicht van 140 tot 160 kDa met tetramer-subeenheden . Een zeer laag moleculair gewicht van 11,2 kDa werd gedetecteerd voor Streptobacillus sp. Kk2s4 asparaginase .

figuur 1

een typisch elutieprofiel voor de chromatografie van asparaginase van P. vulgaris op deae-Sefarose-kolom (15 × 1,6 cm i.d.) voorheen geëquilibreerd met 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0 bij een debiet van 60 mL / uur en 3 mL fracties.

Figuur 2

Gelfiltratie van asparaginase I uit Deae-Sefarosefractie op de sephacryl s-200-kolom (90 × 1,6 cm i. d.). De kolom werd geëquilibreerd met 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0 bij een debiet van 30 mL/uur en 3 mL fracties.

Figuur 3

SDS-PAGE for homogenity and molecular weight determination of asparaginase I from Phaseolus vulgaris. (1) eiwitmarkers; (2) Sephacryl s-200 asparaginase I.

de substraatspecificiteit van asparaginase I is onderzocht met behulp van een aantal asparagine-en glutamineanalogen (Tabel 2). De activiteit met de l-asparagine werd beschouwd als 100% activiteit. DL-asparagine vertoonde 30% van de enzymactiviteit, waar DL-asparagine uit een 1 bestaat : 1 racemisch mengsel. D-asparagine, L-asparaginezuur en L-glutaminezuur-analogen hadden een zeer lage activiteit in de richting van asparaginase I. Er werd geen activiteit gedetecteerd in aanwezigheid van L-glutamine. Daarom is asparaginase I van P. vulgaris vrij van glutaminase. De contaminatie van asparaginase met glutaminase-activiteit veroorzaakte bijwerkingen tijdens de behandeling tegen kanker . De L. arboreus asparaginase gehydrolyseerde alleen L-asparagine en DL-aspartylhydroxamaat . De V. unguiculata asparaginase was specifiek voor L-asparagine, hydrolyseerde D-asparagine niet en was niet specifiek voor L-glutamine .

kinetische parameters, Km en Vmax van gezuiverd enzym, bleken respectievelijk 6,72 mM asparagine en 0,16 µM ammoniak/mL te zijn (figuur 4). Vergelijkbare Km-waarden van 6,6 en 7,0 mM werden bepaald voor asparaginases van respectievelijk L. arboreus en L. angustifolius . Asparaginase uit Lupinuszaden heeft een hoge Km voor asparagine (12,2 mM) . Lage Km (1.2 mM) werd bepaald voor asparaginase uit V. unguiculata . Voor bacteriën waren de Km-waarden voor L-asparaginase van Escherichia coli en Erwinia carotovora respectievelijk 3,5 en 7,14 mM .

Figuur 4

lineweaver-Burk plot met betrekking tot asparaginase I van P. vulgaris snelheden tot verschillende L-asparagineconcentraties.

Asparaginase I vertoonde een pH-optimum bij 8,0 (Figuur 5). Tussen pH 6,0 en 9,0 bleef meer dan 50% van de activiteit behouden. Hoewel maximale activiteit bij fysiologische pH een van de voorwaarden is voor L-asparaginase voor antitumoractiviteit, zou het gezuiverde enzym nuttig zijn omdat 80% van de enzymactiviteit bij pH 7,5 werd behouden. Het enzym vertoonde stabiliteit bij alkalische pH (pH 7,5–9,0) aangezien het 90% van zijn oorspronkelijke activiteit behield wanneer het tot 24 uur werd geïncubeerd (Figuur 6). Het pH-optimum van L-asparaginases van verschillende planten varieerde echter van 8,0 tot 8,5 . De meeste l-asparaginases van bacteriën vertoonden alkalische pH-optima (8,0-10).

Figuur 5

pH optimum van asparaginase I van P. vulgaris. De enzymactiviteit werd gemeten bij verschillende pH ‘ s met behulp van de standaard testmethode zoals eerder beschreven.

Figuur 6

pH-stabiliteit van asparaginase I van P. vulgaris bij een andere pH na incubatie gedurende 24 uur bij 4°C.

Asparaginase I bleek een optimale temperatuur te hebben bij 37°C (Figuur 7). Er werd een vergelijkbaar temperatuuroptimum van asparaginase van V. unguiculata (40°C) gemeld . Deze temperatuur was ook vergelijkbaar met die voor Pseudomonas aeruginosa en Pectobacterium carotovorum . De optimale activiteit van Streptobacillus sp. asparaginase werd geregistreerd bij 35°C . Integendeel, L-asparaginase van Chrombacteriaceae en Proteus vulgaris werd waargenomen bij respectievelijk 20°C en 57°C . Er werd een niet-lineair verband tussen asparaginase I en temperatuurstabiliteit vastgesteld (Figuur 8). De enzymactiviteit was stabiel tot 37°C na incubatie gedurende 1 uur. Asparaginase uit V. unguiculata was stabiel tot 40°C na incubatie gedurende 15 minuten . Asparaginasen van P. carotovorum en C. annuum behielden hun initiële activiteit na incubatie bij respectievelijk 40°C en 45°C gedurende 60 minuten .

Figuur 7

temperatuur optimaal van asparaginase I van P. vulgaris. De enzymactiviteit werd gemeten bij verschillende temperaturen met behulp van de standaardtestmethode zoals eerder beschreven.

Figuur 8

thermische stabiliteit van asparaginase I van P. vulgaris. Het reactiemengsel werd bij verschillende temperaturen gedurende 60 minuten voor substraattoevoeging voorgeïncubeerd, gevolgd door afkoeling in een ijsbad. De enzymactiviteit werd gemeten met behulp van de standaardtestmethode zoals eerder beschreven. Activiteit op nul tijd werd genomen als 100% activiteit.

het effect van verschillende metaalionen op asparaginase I werd onderzocht (Tabel 3). De metaalionen werden gebruikt in een concentratie van 10 mM. K+ kon de activiteit van asparaginase I aanzienlijk verbeteren met 150%. In planten waren K+-onafhankelijke en K+-afhankelijke asparaginasen geïdentificeerd . K+ werkte ook als versterker op P. carotovorum asparaginase . Ca2+ verhoogde de activiteit enigszins met 110%, maar Cu2 + remde de activiteit van asparaginase I. bovendien veroorzaakten Pb2+ en Hg2+ een gedeeltelijk remmend effect op asparaginase I. Echter, V. unguiculata asparaginase werd geactiveerd door Ni2+ en Co2+ en werd geremd door Mn2+, Zn2+, Ba2+ en Hg2+ . EDTA als metaalchelator veroorzaakte een gedeeltelijk remmend effect op asparaginase I. EDTA had echter geen effect op P. carotovorum asparaginase .

4. Conclusies

De L-asparaginase I van P. vulgaris werd gezuiverd in glutaminasevrije vorm, wat de kans op bijwerkingen tijdens de behandeling tegen kanker kan verminderen. Het enzym toonde goede stabiliteit over een brede waaier van fysiologische voorwaarden zoals pH en temperatuur. In de volgende stap van ons project zal L-asparaginase I van P. vulgaris worden gebruikt als potentiële kandidaat voor de behandeling van acute lymfoblastische leukemie.

belangenverstrengeling

de auteurs hebben geen belangenverstrengeling die relevant is voor deze paper.

Dankbetuigingen

dit project werd gefinancierd door het Nationaal Plan voor Wetenschap, Technologie en innovatie (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Saudi Arabia, award no. (11-BIO-1516-03). De auteurs erkennen ook met dank Science and Technology Unit, King Abdulaziz University, voor technische ondersteuning.