Introdução
Biotecnologia emprega microrganismos, bem como maior células e seus princípios ativos, com o objetivo de alcançar a desejável conversões de vários substratos (Tripathi et al., 1997). L-fenil acetil carbinol é o material de partida para a síntese química de cloreto de hidro-efedrina e compostos farmacêuticos de pseudo-efedrina usados como descongestionante, antiastmáticos (Shin e Rogers, 1995) e recentemente relatados, usados no controle da obesidade (Astrup et al., 1992). O substrato aromático benzaldeído dará l-PAC pelo método de biotransformação. Certas cepas de levedura possuem piruvato descaroxilase (PDC) e Alquil desidrogenase (ADH) enzimas que produzem l-PAC e álcool benzílico, um por produto, respectivamente de benzaldeído (Nikolova e Ward, 1991). Potenciais de biotransformação das células em crescimento células colhidas livres células imobilizadas e isolado bruto, bem como enzima purificada têm abelha n extensivamente estudado (Liew et al., 1995; Shin and Rogers, 1996a, b).
o papel de novas cepas na bioconversão é um aspecto importante. A produção de l-PAC foi estudada por células livres e imobilizadas de saccharomyces cerevisiae sob várias condições de crescimento e biotransformação. Mas nós estudamos a produção de l-PAC do benzaldehyde usando várias tensões novas sob várias modalidades do crescimento e da biotransformação com vista monitorar as circunstâncias ideais que permitem o rendimento máximo do produto na concentração constante da carcaça e na densidade de pilha. A produção de l-PAC é dada no Esquema 1.
| regime 1: | |
Materiais e Métodos
Produção de L-fenil-Acetil-Carbinol com Células Normais de Sccharomuces Cerevisiae (POR)
Produção de L-Pac (uma chave intermediária para muitas drogas) de benzaldeído por leveduras é a rota potencial de Fermentação para a produção de Efedrina e outras drogas. O presente estudo foi conduzido pelo autor no Sultan-Ul-Uloom college of Pharmacy, localizado em Hyderabad, Índia, no ano de 2004.A cultura de estoque de fermento de padeiro foi recentemente subculturada (Ellaiah e Krishna, 1987) em inclinações médias Yema estéreis frescas e incubadas à temperatura ambiente (cerca de 28°C) por 36 h. Assim, a cultura de 36 h foi usada para a colheita. A cultura de levedura de padeiros foi colhida agitando em 5 mL de água estéril. A suspensão microbiana colhida foi transferida para o meio do inóculo-I. A composição do meio do inóculo é a seguinte:
o frasco foi incubado a 28°C em um agitador rotativo (180 RPM) por 24 h.
a contagem microbiana foi feita por meio da câmara de contagem de Neubauer. A suspensão microbiana foi diluída para que cada mL de suspensão contivesse 200×106 células. Dez ml de inóculo de IM-fui transferido para 100 mL de inoculação médio-II, que a composição é indicada abaixo:
Os frascos foram incubados em um rotary shaker (180 RPM), durante 16 h.
cem mililitro de meios de produção foram preparadas. Na maior parte do estudo, o meio melaço utilizado como meio de produção e, para comparação, o meio de suco de cana-de-açúcar com ureia foi utilizado como meio de produção. Dez mililitros de inóculo de IM-II foram transferidos para meios de produção cuja composição é igual a IM-II e incubados por 9 h em agitador rotativo. Às 9 h, nutriente (20 mL de melaço a 50%) foi adicionado ao meio de produção de melaço e nutriente (20 mL de suco de cana-de-açúcar a 50%) foi adicionado ao meio de produção de cana-de-açúcar respectivamente e incubado em agitador rotativo. A partir de 10 h em diante 0.6% de benzaldeído destilado foi adicionado em 6 doses divididas de intervalos de meia hora ao meio de produção.
, em Seguida, frascos foram incubados em rotary shaker por 24 h. os frascos contendo 130 mL de caldo de carne (por exemplo,100 mL de produção médio+10 mL de inóculo+20 mL de meio nutriente) foi tratado com 130 mL de benzeno (solvente) e abalado por l5 min no erlenmeyer. Em seguida, a camada orgânica foi separada e filtrada através de algodão absorvente. Finalmente, o benzeno solvente foi destilado para obter o produto L-PAC.
produção de l-fenil acetil Carbinol com novos isolados de leveduras:
procedimentos para bioconversão:
em estudos comparativos, as novas culturas foram usadas para estimar e comparar seu potencial de biotransformação com levedura de padeiros. As culturas de estoque de Candida pseudointermedia MTCC No. 6225, Candida pseudountermedia MTCC No. 6352 e Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 foram subculturadas assepticamente em inclinações de Yema Estrile com alça de transferência esterilizada na área estéril (fluxo de ar Laminar).
procedimento mencionado anteriormente (Ellaiah e Krishna, 1987) foi repetido para as novas cepas também. Na maior parte do estudo, o meio melaço foi utilizado como meio de produção e, para estudo comparativo, o meio suco de cana-de-açúcar com ureia (Kaur e Kocher, 2002) foi utilizado como meio de produção.
resultados e discussão
l-Fenil acetil carbinol é um líquido de cor amarela. Sua gravidade específica relatada é de 0,93 à temperatura ambiente. O L-PAC produzido por isolados, incluindo leveduras de padeiros (S. cerevisia), mostrou o mesmo valor de gravidade específica. o valor de pH de l-PAC (razão 1: 1 da amostra de l-PAC e água) é relatado como 3,84. Neste experiências a L-PAC produto obtido por meio de biotransformação por quatro diferentes leveduras como fermento de padeiro, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) e Issatchenkia orientials (6351) apresentaram os mesmos valores de pH. O valor de Rf de l-PAC foi relatado (Groger e Erge, 1965) em clorofórmio como fase móvel em vapores de iodo de sílica gel foram usados para a detecção de manchas.
no desenvolvimento de cromatogramas, o clorofórmio como solvente frontal foi comparado com a mistura de solvente (30% acetato de etila 70% hexano) como fase móvel. A frente do solvente posterior mostrou melhor separação do que o clorofórmio. Assim, usamos 30% de acetato de etila e 70% de hexano como frente solvente em todos os nossos experimentos.
L-PAC é reativo em luz UV, vapores de iodo e β-Metoxinaftaleno carbonização também. O valor de Rf do padrão L-PAC é de cerca de 0,33. O produto L-PAC de diferentes isolados apresentou o mesmo valor de Rf.
o metilcetona presente em L-PAC sofre a reação Idoforme (Smith e Hendlin, 1954). Inicialmente sofre halogenação e a clivagem na presença de álcalis como NaOH para dar origem a Idoform. Esta reação é muito específica para L-PAC e não ocorre com por produtos. O L-PAC produzido por diferentes isolados deu origem ao Idoform.
por estimativas polarimétricas e colorimétricas, a porcentagem de bioconversão foi estimada em diferentes isolados de levedura. Outros produtos de fermentação (por exemplo, álcool benzílico, ácido benzóico, bem como benzaldeído não convertido foram testados por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e cromatografia gasosa (GC). A estrutura química do L-PAC foi identificada e conformada com dados espectrais de 1h NMR e UV.
vários trabalhadores (Ellaiah e Krishna, 1987) realizaram fermentação em melaço como meio de produção, além disso, na indústria, usam meio de melaço para reação de bioconversão na produção de l-PAC.
na presente investigação, testamos o suco de cana-de-açúcar como meio de produção na produção de l-PAC. O suco de cana-de-açúcar com ureia a 0,25% foi utilizado como meio de produção que produziu mais Produto De L-PAC do que melaço. Além disso, a extração do produto do meio de suco de cana-de-açúcar era muito conveniente do que do meio de melaço. A % bioconversão obtida com diferentes isolados de levedura é mostrada na Tabela 1.
o potencial de biotransformação de células livres de levedura de padeiros (S. cerevisiae) foi estudado tanto no melaço quanto no suco de cana-de-açúcar como meio de produção. Em meio de melaço observou-se bioconversão de 25% onde como em meio de suco de cana-de-açúcar observou-se bioconversão de 28%.
| Quadro 1: | Conversão de melaço e caldo de cana como de produção de mídia, sobre a produção de L-PAC |
Biotransformação potencial livre de células de Candida pseudointermedia MTCC Nº 6225 foi estudada em ambos os melaço de cana-de-açúcar e o suco de produção médio. No melaço observou-se bioconversão de 23,43% onde, como no suco de cana-de-açúcar, observou-se bioconversão de 23,75%.
potencial de biotransformação de células livres de Candida pseudointermedia MTCC no. 6352 foram estudados tanto no melaço quanto no suco de cana-de-açúcar como meio de produção. No melaço observou-se bioconversão de 33,47% onde, como no suco de cana-de-açúcar, observou-se bioconversão de 48,76%.
potencial de biotransformação de células livres de Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 foi estudado em melaço e suco de cana-de-açúcar como meio de produção. No melaço observou-se bioconversão de 37,16% onde, como no suco de cana-de-açúcar, foi observada bioconversão média de 60,61%.
conclusão
em conclusão, o presente procedimento para o uso de novas cepas de leveduras de fontes naturais para estudos de biotransformação foi investigado e utilizado para a bioconversão de benzaldeído para L-PAC. Três cepas foram isoladas de diferentes fontes naturais como blackgrapes, tâmaras e suco de cana-de-açúcar e foram identificadas no Instituto de tecnologia microbiana, Chandigarh. Essas três cepas foram designadas como Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 (BGY), issatchenkia orientials MTCC No. 6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 (SCY).Que será uma adição importante aos procedimentos atuais existentes. Os achados mais significativos da presente pesquisa são o uso de 3 novas cepas de leveduras para a produção de l-PAC e o uso de suco de cana-de-açúcar como meio de produção para a produção de l-PAC. Somos bem sucedidos em ambas as tentativas e há um aumento considerável no rendimento percentual de L-L-PAC quando o suco de cana-de-açúcar foi usado como meio de produção. Embora o suco de cana-de-açúcar seja caro em comparação com o melaço, o procedimento de extração provou ser muito mais fácil com o suco de cana-de-açúcar em comparação com o melaço. Outras modalidades de pesquisa, como diferentes fatores, estudos de imobilização, estudos de mutação etc., poderia ajudar a estabelecer os métodos econômicos para a produção de l-PAC usando o suco de cana-de-açúcar como meio de produção. Este é o primeiro relatório sobre o uso de Candida pseudointermedia e Issatchenkia orientalis para estudos de bioconversão de benzaldeído para L-PAC. O uso de suco de cana-de-açúcar como meio de produção em estudos de biotransformação de benzaldeído para L-PAC também é o primeiro relato desse tipo. Além disso, o suco de cana-de-açúcar mostrou maior potencial de bioconversão do que o melaço médio. As novas cepas que podemos explorar para as diferentes reações químicas. Mais estudos nessa direção estão em andamento.
agradecimentos
os autores são gratos à IMTECH, Chandigarh por identificar as novas cepas e atribuir os números MTCC.
