Alta definição & Eficiente PCR Enzima: KOD DNA polimerase
O hyperthermophilic archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (anteriormente Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) foi isolado de uma fonte termal solfatárica (Fig. 2) Na Ilha Kodakara (Fig. 3) no Japão, e foi identificado e caracterizado.
uma família B DNA polimerase (kod DNA polimerase) foi encontrada nesta cepa KOD1 e mostra várias propriedades únicas (1).
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Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
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Fig. 2. Solfatara (Kodakara ilha, Japão)
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Fig. 3. Ilha Kodakara (Prefeitura de Kagoshima, Japão)
a polimerase do ADN de Kod exibe a atividade forte da exonuclease de 3’→5′ (atividade da prova-leitura), uma atividade que a polimerase do ADN de Taq carece.Além disso, esta enzima exibe excelente capacidade de processividade e alongamento, mostrando uma taxa de extensão cinco vezes maior (100-130 nucleotídeos / segundo) e 10-15 vezes maior processividade (>300 bases) do que a de Pyrococcus furiosus (PFU DNA polimerase). A taxa de alongamento desta enzima é aproximadamente 2 vezes maior que a da Taq DNA polimerase (Tabela 1)(Fig. 4) (1).
Quadro 1. Propriedades de termoestável DNA polimerases
| Proterty | Valor indicado DNA polimerase | ||
|---|---|---|---|
| KOD DNA polimerase | Pfu DNA polimerase | Taq DNA polimerase | |
| Origem | Archaea | Archaea | Bactérias |
| Deduzida a massa molecular (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| melhor temperatura (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| Ideal pH em 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| estabilidade térmica (meia-vida) | 95,de 12 h; 100oC,3.0 h | 95, 6h; 100ºC, de 2,9 h | 95, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Comparação das taxas de alongamento de kod PFU e Taq DNA polimerase.
a taxa de alongamento foi medida de acordo com o comprimento do DNA sintetizado, usando M13 ssDNA como modelo a 75ºC.
paralelamente ao estudo das atividades da kod DNA polimerase, foram desenvolvidos anticorpos de neutralização para a polimerase e atividades de Revisão (2). Esses anticorpos podem ser aplicados à “tecnologia Hot start PCR” usando kod DNA polimerase.
a estrutura 3-D da DNA polimerase foi caracterizada em 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. Estrutura 3-D da kod DNA polimerase
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (código No. Kod-201) foi desenvolvido com base na polimerase de DNA KOD e exibe alta fidelidade de PCR (Tabela 2).
Quadro 2. Comparação da frequência de mutação de cada enzima PCR.
| Total de bases Seqüenciadas | Número de mutantes bases | frequência de Mutação (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD -Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu DNA polimerase | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-base de long-PCR enzima | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq DNA polimerase | 102,708 | 145 | 141.2 |
a Fidelidade foi medido como a mutação de frequência por sequenciamento do produto de PCR. Após a clonagem do produto PCR (2,4 kb da região humana da beta-globina), cerca de 96 clones foram selecionados e sequenciados.
kod FX (código no. KFX – 101) foi desenvolvido com base na polimerase de DNA KOD e mostra uma taxa de sucesso de PCR muito maior (com base nas capacidades de eficiência e alongamento) do que KOD-Plus- (código No. KOD-201) ou outras enzimas PCR baseadas em Taq. Kod FX também é eficaz para amplificação de espécimes brutos (por exemplo, lisado de cauda de rato, células cultivadas).
Fig. 6. Amplificação direta de um lisado bruto da cauda do rato
1,2: kod FX
3~6: enzimas de outra empresa
M: marcadores
