- Resumo
- 1. Introdução
- 2. Materiais e reagentes
- 2.1. Isolamento e cultivo de células epiteliais Limbais humanas
- 2.2. Ensaio de eficiência de formação de colônias(CFE)
- 2.3. Ensaio de duplicação da população celular
- 2.4. Extração de RNA e Reação Em Cadeia quantitativa da polimerase em tempo Real
- 2.5. Coloração imunofluorescente
- 2.6. Análise de Western Blot
- 2.7. Estatísticas
- 3. Resultados
- 3.1. O fenótipo de células-tronco epiteliais da córnea em meio SR
- 3.2. Ensaio CFE
- 3.3. PCR e análise PCR em tempo Real
- 3.4. Coloração imunofluorescente
- 3.5. Western Blot
- 4. Discussão
- interesses concorrentes
- agradecimentos
Resumo
O límbicas células epiteliais pode ser mantido no 3T3 alimentador camada com soro bovino fetal complementado meio de cultura, e essas células têm sido usadas com sucesso para tratar de células-tronco límbicas deficiência. No entanto, o soro bovino fetal contém componentes desconhecidos e exibe variações quantitativas e qualitativas de lote para lote. Para melhorar a condição de cultura, a substituição definida do soro nocaute foi investigada para substituir o soro bovino fetal para a cultura de células epiteliais limbais humanas. Células epiteliais limbais primárias humanas foram cultivadas em soro nocaute e soro bovino fetal suplementado médio, respectivamente. A taxa de crescimento celular, expressão gênica e manutenção de células-tronco epiteliais limbais foram estudadas e comparadas entre esses dois grupos. As células epiteliais limbais primárias humanas foram isoladas e cultivadas com sucesso em série neste novo meio suplementado com soro nocaute; a proliferação celular e a manutenção de células-tronco foram semelhantes às de células cultivadas em meio suplementado com soro fetal bovino. Esses dados sugerem que este meio suplementado com soro nocaute é uma substituição eficiente do meio suplementado com soro fetal bovino tradicional para cultura de células epiteliais limbais, e esse meio tem grande potencial para manutenção a longo prazo de células epiteliais limbais, transplante de células-tronco epiteliais limbais e regeneração tecidual.
1. Introdução
as células-tronco epiteliais da córnea estão localizadas na camada basal do Limbo, uma estrutura corrugada e pigmentada chamada paliçadas de Vogt . Essas células-tronco sustentam a renovação contínua do epitélio da córnea ao longo da vida e substituem as células epiteliais da córnea lesionadas ou perdidas . A deficiência de células-tronco limbais (LSCD) e doenças da superfície ocular associadas podem ser tratadas com sucesso usando autoenxerto epitelial limbal cultivado . O sucesso desses tratamentos cirúrgicos depende da expansão eficiente das células-tronco epiteliais limbais que envolveram a camada alimentadora 3T3 e o soro fetal bovino (FBS) na maioria dos casos. O sistema da cultura da camada do alimentador 3T3 foi estabelecido por Rheinwald e por verde e foi usado com sucesso para expandir pilhas epiteliais da pele humana, do folículo de cabelo, do limbus, da conjuntiva, e do tecido oral da mucosa . No entanto, o FBS não está bem definido e sempre exibe variações quantitativas e qualitativas de lote para lote . O FBS também contém componentes xenogênicos potencialmente prejudiciais, que podem estimular reações imunológicas e transmitir doenças e patógenos animais . Com todas essas preocupações, há uma necessidade crescente de desenvolver um meio de cultura bem definido para substituir o meio suplementado FBS tradicional.
Atualmente, existem certas soro livre de mídia alternativa para o crescimento de células epiteliais, tais como definidos Keratinocyte Soro-Livre Médio (KSFM™, Invitrogen, EUA), keratinocyte meio de crescimento (KGM™, Clontech, EUA), Epilife™ (Invitrogen, EUA), e de Células Progenitoras Alvo (PCT) media (CellnTEC™, Suíça). Esses produtos demonstraram apoiar a expansão das células epiteliais da córnea. No entanto, eles ainda precisam de suplementos de produtos indefinidos, como extrato de hipófise bovina (BPE) ou albumina sérica humana (HAS). E a maioria desses meios requer alta densidade de semeadura celular, o que pode não ser prático para a expansão das células epiteliais da córnea humana. Além disso, as células-tronco epiteliais da córnea, que são detectadas como holoclones no sistema de cultura 3T3, não puderam ser mantidas neste meio de cultura sem soro a longo prazo . Até o momento, não existe um meio livre de soro definido que possa suportar a expansão das células-tronco epiteliais da córnea a longo prazo.
KnockOut serum replacement (SR) é uma formulação definida sem soro, que foi projetada para substituir diretamente o FBS para manutenção de células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Foi demonstrado que o KnockOut SR fornece condições de crescimento consistentes para a cultura de células ES e iPSC, e as células ES cultivadas em meio suplementado com KnockOut SR são substancialmente menos diferenciadas do que as cultivadas em meio suplementado com FBS, e a transmissão germinativa não é comprometida no mínimo. Dadas as semelhanças nos métodos de cultura de células epiteliais e células ES, e à luz do fato de KnockOut Sr substituir FBS na cultura de células ES, aqui é hipotetizado que o KnockOut SR poderia ser usado para substituir FBS na cultura de células epiteliais limbais.
2. Materiais e reagentes
pratos de cultura celular, frascos, tubos de centrífuga e pipetas sorológicas foram adquiridos de Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Ham F-12, HEPES, penicilina e estreptomicina, L-glutamina, 0,05% tripsina-0.A solução EDTA a 02%, O Kit Superscript III e o Kit RNeasy™ foram adquiridos da Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). O soro fetal bovino (FBS) foi adquirido da Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Os fibroblastos NIH 3T3 do rato (ATCC CCL 92) foram obtidos da coleção Americana da cultura do tipo (Rockville, DM; http://www.atcc.org/). Dispase II era da Roche. O anticorpo Monoclonal (mAb) contra ABCG2 (clone BXP-21) e connexin 43 eram do Millipore; p63 (clone 4A4), K5, e K19 veio de Santa Cruz; K3 mAb (clone AE5) foi a partir do ICN Farmacêutica (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). O anticorpo secundário anti-ratinho de cabra conjugado Alexa Fluor 568 foi de Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR e Taqman universal PCR Master Mix AmpErase UNG kits foram de Biossistemas aplicados (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomicina C, insulina bovina, transferrina humana, hidrocortisona, fator de crescimento epidérmico humano (FEG), toxina da cólera e outros reagentes foram de Sigma-Aldrich (St.Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Isolamento e cultivo de células epiteliais Limbais humanas
os anéis córnea-limbais foram colhidos de cinco doadores saudáveis logo após o transplante de córnea, buscou-se consentimento informado e o protocolo de colheita de amostras foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade de Jilin. Anéis de córnea-limbal frescos foram tratados com 0,25% de Dispase II a 4°C durante a noite, e a camada epitelial foi esfregada do tecido do estroma subjacente e tratada com 0,05% de tripsina-0,02% de EDTA a 37°C por 15 minutos. A atividade da tripsina foi neutralizada por 10% FBS e células epiteliais limbais dissociadas foram coletadas e centrifugadas a 1.500 rpm por 5 minutos. A viabilidade das células epiteliais foi determinada pelo azul de tripano, excluindo a coloração e o número de células foi contado usando hemocitômetro.
fibroblastos de rato 3T3 foram mantidos no meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM, glicose alta) suplementado com 10% de FBS, L-glutamina (2 mM) e penicilina-estreptomicina (50 UI/mL) e cultivado com 5% de CO2 e atmosfera umidificada. As células 3T3 foram subculturadas a cada 6 dias ao atingir 80-90% de confluência. As células 3T3 foram mantidas em série e apenas as células antes da passagem 20 foram usadas para a preparação da camada de alimentação. Para preparar o alimentador de camada, confluente 3T3 células foram tratadas com a mitomicina C (10 µg/mL) por 2 horas a 37°C, lavadas com PBS por duas vezes, e tratados com 0,05% de tripsina por 5 minutos a 37°C. fibroblastos 3T3 foram coletados e banhado em uma densidade de 30.000 células/cm2 um dia antes da semeadura células epiteliais.
células epiteliais limbais humanas foram cultivadas em camada alimentadora 3T3 usando meio da moda ou meio de substituição sérica (SR). A MODA médio é uma mistura de meio DMEM e Ham F-12 média (1 : 1), contendo 10% de soro bovino fetal, L-glutamina (2 mM) e penicilina-estreptomicina (50 UI/mL), fator de crescimento epidérmico (10 ng/mL), insulina (5 µg/mL), adenina (0,18 mM), hidrocortisona (de 0,4 µg/mL), toxina da cólera (0,1 nM), e a tri-iodotironina (2 nM). O SR médio é uma mistura de meio DMEM e Ham F-12 média (1 : 1) contendo 10% de Nocaute SR soro de substituição, L-glutamina (2 mM) e penicilina-estreptomicina (50 UI/mL), fator de crescimento epidérmico (10 ng/mL), insulina (5 µg/mL), adenina (0,18 mM), hidrocortisona (0.4 µg/mL), toxina da cólera (0,1 nM), triiodotironina (2 nM), transferrina (5 µg/mL) e selênio (5 ng/mL). As células epiteliais limbais foram semeadas na camada alimentadora 3T3 a uma densidade de 6.000 células / cm2 e cultivadas com 5% de CO2 e atmosfera umidificada. O meio da moda foi alterado a cada 3 dias, enquanto o meio SR foi alterado a cada 2 dias.
2.2. Ensaio de eficiência de formação de colônias(CFE)
para o ensaio CFE, 200 células epiteliais limbais Humanas da cultura da moda ou Cultura SR foram revestidas em uma placa de petri de 100 mm contendo mitomicina tratada com C camada alimentadora 3T3 e cultivadas conforme descrito acima. Após a cultura de 12 dias, os pratos foram fixados com formalina a 10% por 30 minutos à temperatura ambiente e corados com rodamina B a 1% por mais 30 minutos. Após a lavagem com água destilada, os números das colônias foram contados e analisados. A eficiência de formação de colônias foi expressa como o número de colônias formadas divididas por 200.
2.3. Ensaio de duplicação da população celular
as células epiteliais Limbais foram mantidas na camada alimentadora 3T3 tratada com mitomicina usando meio da moda ou meio SR. As células epiteliais foram tripsinizadas ao atingir 80-90% de confluência e passadas a uma densidade de 6.000 células/cm2. As culturas foram mantidas em série por 10 passagens. Em cada passagem, as células epiteliais limbais foram colhidas e o número de células foi contado. O número de duplicações populacionais (DP) para cada passagem foi calculado de acordo com a seguinte fórmula: , onde representa o número total de células obtidas em cada passagem e representa o número de células de revestimento no início.
2.4. Extração de RNA e Reação Em Cadeia quantitativa da polimerase em tempo Real
para avaliar o nível de expressão gênica das células epiteliais limbais, PCR e PCR em tempo real foram realizadas. O RNA total foi extraído das células epiteliais da córnea usando o kit RNeasy seguindo as instruções do fabricante. O RNA foi quantificado por sua absorção a 260 nm e armazenado a -80°C. Para sintetizar cDNAs, foram utilizados 1 µg de RNA total com Kit de transcrição reversa sobrescrito III. A PCR foi realizada usando Platinum PCR Master mix( Life Technology); e a PCR em tempo real foi realizada usando o SYBR Green PCR Master Mix (Roche) com os primers descritos anteriormente . As reações de PCR em tempo Real foram realizadas em triplicado com uma etapa inicial de ativação a 95°C por 3 minutos, seguida por 45 ciclos: 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos e 72°C por 40 segundos. A expressão gênica relativa foi calculada normalizando a diferença no valor limite do ciclo (delta Ct), valores dos genes para o valor Delta Ct de gliceraldeídos-3-fosfato desidrogenase (GAPDH).
2.5. Coloração imunofluorescente
células epiteliais limbais humanas foram semeadas em lâminas de cultura com camada alimentadora 3T3 em meio da moda ou meio SR. Três dias após a semeadura, as culturas foram fixadas com paraformaldeído a 4% ou acetona fria a 4°C por 10 minutos. Após a lavagem com PBS duas vezes, as células foram bloqueadas com soro de cabra a 5% em PBS por 30 minutos. O mouse primária de anticorpos contra o p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3 (1 : 400, Millipore), e connexin 43 (1 : 1000, Millipore) foram aplicados e incubadas overnight a 4°C. Alexa Fluor 568-conjugado anticorpo secundário foi aplicada durante 1 hora, após lavagem com PBS por duas vezes. Os núcleos celulares foram então contraestanhados com Hoechst 33342 (1 µg / mL em PBS) por 20 minutos. Após a lavagem com PBS por 3 vezes, a cultura celular foi montada com meio de montagem (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e examinada sob um microscópio fluorescente (BX50; Olympus, Tóquio, Japão).
2.6. Análise de Western Blot
células epiteliais limbais cultivadas foram lisadas com tampão RIPA (10 mm Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% de desoxicolato de sódio, 1% Triton X-100, 1 mm EDTA e coquetel de inibidores de protease; Roche Diagnostics) no gelo por 30 minutos. A concentração de proteína foi quantificada usando ensaio de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Total de lisados de células (40 µg) foram electrophoresed em 12% de inclinação SDS-PAGE em gel, transferidas para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad), bloqueado, com 5% de leite desnatado em solução tampão salina Tris (TBS), durante 1 hora, e sondou com o mouse anticorpos contra a proliferação do núcleo da célula antigen (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore), ou p63 (4A4, Santa Cruz, CA) durante a noite a 4°C. As membranas foram então lavadas três vezes com TBS, incubadas com cabra anti-mouse IgG (1 : 5000, conjugado a HRP, Santa Cruz, CA) ou de coelho anti-IgG de cabra (1 : 5000, HRP-conjugado, Santa Cruz, CA) por 1 hora à temperatura ambiente e desenvolvido com substratos quimioluminescentes aprimorados (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Os níveis de expressão de ABCG2, PCNA E p63 foram medidos usando medida de intensidade semiquantitativa e normalizados para o nível de GAPDH que serviu como controle interno.
2.7. Estatísticas
resumo dos dados de CFE e dobra relativa de PCR em tempo real foi relatado como médias ± SD e comparado usando teste não pareado de Student com Microsoft Excel (versão 2003 / XP). Os resultados dos testes foram relatados como valores bicaudais, onde foram considerados estatisticamente significativos.
3. Resultados
3.1. O fenótipo de células-tronco epiteliais da córnea em meio SR
um total de 5 tecidos do anel córnea-limbal foram colhidos de doadores na faixa etária de 32 a 65 anos. Esses tecidos foram preservados e processados dentro de 24 horas após a colheita. A cultura de células epiteliais da córnea primária humana foi estabelecida com sucesso em meio da moda (Figuras 1(A) e 1(b)) e meio SR (Figuras 1(c) e 1(d)) também. As células epiteliais da córnea mantidas na camada alimentadora SR medium + 3T3 apresentaram morfologia com tamanho pequeno e alta relação núcleos/citoplasma, que era típica morfologia de células epiteliais indiferenciadas, e as grandes células escamosas planas diferenciadoras raramente foram observadas (Figura 1(c)). As células epiteliais mantidas em meio SR começaram a formar colônias 3 dias após a semeadura (Figura 1(c)). Os tamanhos dessas colônias eram semelhantes aos formados dentro da camada alimentadora FAD medium + 3T3 (Figura 1(A)), mas essas colônias eram menos compactadas do que as da camada alimentadora FAD + 3T3. Dentro de 7 dias, as células epiteliais atingiram confluência em meio SR com tamanho pequeno uniforme (Figura 1 (d)), O que também foi observado na cultura da moda (Figura 1(b)). Neste estudo, as células epiteliais da córnea humana poderiam ser derivadas e mantidas na camada alimentadora SR medium + 3T3 para todos os cinco doadores. Para o cultivo a longo prazo, as células epiteliais da córnea humana foram subculturadas em série na camada alimentadora SR medium + 3T3 por mais de 10 passagens (). Durante cada passagem, as células foram tripsinizadas e coletadas quando as células atingiram 80-90% de confluência; os números de células foram calculados para o ensaio de duplicação populacional. O resultado mostra que o rendimento das células epiteliais do meio SR é próximo ao das células cultivadas no meio da moda, como mostrado na Figura 2 (A), E esses dados são semelhantes aos relatórios anteriores . Em resumo, os dados aqui apresentados mostram que o meio de Cultura SR + a camada alimentadora 3T3 tratada com mitomicina C suporta o crescimento e proliferação clonal de células epiteliais da córnea humana.
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d)
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d)
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3.2. Ensaio CFE
em seguida, examinamos e comparamos o CFE de células epiteliais da córnea cultivadas em FAD e SR media. Para a análise do CFE, foram colhidas e semeadas células epiteliais corneanas cultivadas em meio SR e FAD a uma densidade de 200 células por placa de petri de 100 mm, que foi pré-semente com camada alimentadora 3T3 tratada com mitomicina, e essa cultura foi permitida crescer por 12 dias. As células epiteliais da córnea começaram a formar colônias 5-7 dias após o início da cultura. Como mostrado na Figura 2 (b), Após a cultura por 12 dias, as células epiteliais da córnea mantidas em meio SR exibiram CFE e tamanho de Colônia semelhantes em comparação com as células mantidas em meio da moda. O valor de CFE para as células epiteliais nos meios SR e FAD foi e, respectivamente (Figura 2(c)). A análise estatística demonstrou que não houve diferenças significativas na eficiência de formação de colônias () e na área média das colônias () entre a SR e a mídia da moda (Figura 2(c)). Quantificamos a porcentagem dos tipos de colônias com base na área das colônias. Os resultados mostraram que a porcentagem de colônias abortivas (área de Colônia <1 mm2) formadas em meio SR foi semelhante à do meio da moda (). Da mesma forma, a porcentagem de grandes colônias (área de Colônia >4 mm2) formadas em meio SR foi próxima daquela em meio da moda () (Figura 2(d)). Esses resultados indicam que as células epiteliais da córnea cultivadas em meio SR possuem um grau semelhante maior de potencial proliferativo quando comparadas às células cultivadas em meio da moda.
3.3. PCR e análise PCR em tempo Real
para estudar a expressão gênica, PCR e PCR em tempo real foram realizados em células epiteliais cultivadas em ambos os meios FAD e SR. O gene de limpeza GAPDH foi usado como controle interno. Os dados de PCR mostram que a célula cultivada no meio da moda e no meio SR mostram expressão de transcrição de alto nível do marcador proliferativo PCNA. As células em ambos os meios mostram expressão positiva de citoqueratina 3 e citoqueratina 12, o que é consistente com sua origem limbo. A expressão positiva do marcador de células epiteliais da camada basal, citoqueratina 15, também foi observada em ambas as culturas. A expressão ABCG2 e ΔNp63α foi detectada em ambas as culturas, embora a expressão ABCG2 tenha diminuído ligeiramente após a cultura primária no meio SR. O baixo nível de expressão de conexina 43 foi observado em ambas as culturas e implicou baixo nível de diferenciação de células epiteliais em ambos os meios. Para PCR em tempo real, a análise quantitativa do nível de mRNA mostrou que não houve diferença significativa de expressão () de P63 e ABCG2 entre células epiteliais cultivadas em FAD e mídia SR (Figura 4(A)). Também foi realizada análise em tempo Real do marcador de diferenciação epitelial corneana citoqueratina 3 e citoqueratina 12. Ambos os dois marcadores eram pouco detectáveis nas culturas de células FAD e SR e, surpreendentemente, não há diferença significativa () no nível de expressão entre essas duas culturas.
3.4. Coloração imunofluorescente
para confirmar que as células epiteliais cultivadas em meio SR mantiveram o estado de tronco e indiferenciado, coloração imunofluorescente de vários marcadores de proliferação, diferenciação e células-tronco epiteliais putativas foi realizada. Como mostrado na Figura 4, em meio SR, a maioria das células epiteliais apresentou uma morfologia pequena e uniforme, e a maioria das células foi fortemente corada com P63, o putativo marcador de células-tronco epiteliais. Células coradas positivas ABCG2 também foram observadas em uma distribuição irregular dentro das colônias de células epiteliais limbais. As células mantidas em meio SR foram fracamente coradas para conexina 43 e citoqueratina 3. A baixa expressão desses dois marcadores de diferenciação sugere baixo nível de diferenciação das células epiteliais na cultura celular. O estilo de coloração semelhante também foi observado em células mantidas com meio da moda (Figura 4(b)). Esses dados implicam que as células epiteliais limbais humanas cultivadas em meio SR mantiveram expressão de alto nível de marcadores de células-tronco epiteliais putativos, enquanto expressavam baixo nível de marcadores de diferenciação.
3.5. Western Blot
para confirmar a expressão gênica quantitativa e os resultados da coloração imunofluorescente, a expressão de potenciais marcadores de células-tronco epiteliais (P63 e ABCG2) e Marcador de proliferação (PCNA) foi avaliada usando Western blot. Usando anticorpo P63 monoclonal (clone 4A4, Santa Cruz), a proteína p63 (70 KD, ΔNα isoform) foi detectada em alto nível de expressão em meio SR. A expressão de ABCG2 (70 KD) foi detectada em cada passagem de células cultivadas em meio SR. O PCNA, marcador de proliferação, também foi detectado em células cultivadas em meio SR (Figura 3 (c)). E os níveis de expressão de P63, ABCG2 e PCNA foram semelhantes em 10 passagens com medição de intensidade semiquantitativa (Figura 3(d)) usando GAPDH como controle interno.
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b)
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b)
4. Discussão
células epiteliais cultivadas em camada alimentadora 3T3 foram derivadas e utilizadas com sucesso para o tratamento de várias situações clínicas, como queimaduras graves, úlceras do pé diabético, defeitos da pele e defeitos da mucosa oral . O primeiro transplante de células-tronco epiteliais limbais foi descrito em 1997 por Pellegrini et al. . Durante as últimas décadas, vários métodos de cultura diferentes foram desenvolvidos, incluindo cultura de células epiteliais limbais na membrana amniótica humana (HAM) com ou sem camada alimentadora 3T3 , cultura de células epiteliais em placas sensíveis à temperatura e cultura de células epiteliais com meio de cultura comercial sem soro. Como relatório recente indica que o resultado clínico do transplante de células epiteliais da córnea/limbo depende se as células-tronco limbais são preservadas na cultura celular, foi apontado que os holoclones foram retidos apenas no sistema de cultura FAD + 3T3 . Como este protocolo de cultura envolve o uso de FBS, há crescentes preocupações de segurança de que FBS é produtos de origem animal mal definidos e tem um potencial de transmissão de doenças derivadas de animais para pacientes . Portanto, há uma necessidade crescente de desenvolver meio de Cultura livre de produtos animais e sem FBS para substituir o meio tradicional da moda .
neste estudo, desenvolvemos um novo meio de cultura sem soro, no qual o KnockOut SR substituiu o FBS. Os fenótipos de células-tronco epiteliais limbais neste novo meio de Cultura livre de soro foram avaliados por imunocoloração com anticorpos para marcadores de células-tronco propostos (P63, ABCG2) e marcadores de diferenciação (citoqueratina 3, conexina 43).
o Fator de transcrição nuclear p63 foi proposto anteriormente como um marcador de células-tronco epiteliais, e ΔNα é a isoforma predominante de isoformas p63 nessas células . Nossos resultados são consistentes com esses relatórios anteriores; o P63 nuclear foi fortemente expresso em cultura de células limbais, o que foi mostrado por imunocoloração, PCR em tempo real e Western blot. A presença de p63 na cultura celular limbal indica seu alto potencial proliferativo e de auto-renovação. ABCG2, um membro dos transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC), originalmente conhecido como proteína 1 resistente ao câncer de mama (BCRP1), foi proposto como outro marcador de células-tronco putativo para células-tronco adultas, incluindo células-tronco epiteliais limbo . A alta expressão de ABCG2 no meio SR foi evidenciada por imunocoloração e PCR em tempo real.
K3 e K12 são bem conhecidos como marcadores específicos da córnea . Consistentemente, nossos resultados de imunocoloração e PCR em tempo real mostraram que as células eram K3 e K12 negativas, confirmando sua origem no limbo. Connexin 43 é um membro da família das proteínas da junção da diferença; permite a difusão direta de solutos do baixo peso molecular entre pilhas vizinhas. Foi relatado que a conexina 43 foi expressa por células epiteliais diferenciadas, e a ausência dessas moléculas de comunicação intercelular pode ser uma característica das células-tronco epiteliais.
em nossos resultados, uma porcentagem maior de células expressou p63 e ABCG2, enquanto poucas células expressam marcadores de diferenciação K3 / K12 e CX43. Assim, as células-tronco epiteliais limbais humanas em meio livre de soro Sr apresentaram fenótipos semelhantes e mantêm condições indiferenciadas, em comparação com o meio FBS.
em conclusão, usando KnockOut SR substituindo FBS, nosso novo meio sem soro mantém o crescimento e a proliferação das células epiteliais da córnea humana e retém as células-tronco epiteliais em seu fenótipo indiferenciado. Este novo método de cultura sem soro é definido por suplemento e relativamente fácil de controlar. Tem grande potencial para ser usado na clínica transplante de células epiteliais limbais e regeneração tecidual.
interesses concorrentes
os autores declaram que não têm interesses concorrentes.
agradecimentos
este trabalho foi apoiado por subvenção da Universidade de Jilin e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC 30500548).
