base Estrutural para o reconhecimento de K48-vinculado Ub cadeia por proteasomal receptor Rpn13

K48-vinculado Ub cadeia dinamicamente oscila entre várias conformações

usamos smFRET para avaliar o arranjo espacial dos dois Ub subunidades no ligante livre K48-diUb. Introduzimos fluoróforos, Alexa Fluor 488 e Cy5, no terminal N da Ub distal e no Terminal C da UB proximal (Fig. S1a). Usando algoritmo de maximização de expectação32, o perfil smFRET de K48-diUb pode ser melhor descrito como três espécies de traste sobrepostas(Fig. S2). As espécies de alto, médio e baixo traste estão centradas em eficiências de traste de 0,74, 0,57 e 0,23, com respectivas populações de ~48, ~39 e ~13% (Fig. 1a). As distâncias de traste entre o centro dos fluoróforos são calculadas em ~43, ~50, ~64 Å, respectivamente. Assim, as espécies de alto, médio e baixo traste podem ser atribuídas a Estados compactos, semi-abertos e abertos que são preexistentes para K48-diUb.

a com fluoróforos conjugados no local de 76 C da Ub proximal e 0 C da UB distal (cf. Suplementar Fig. S1A), o perfil smFRET pode ser montado em três espécies de traste sobrepostas. Salvo indicação em contrário, este par de locais de conjugação é usado para todos os estudos smFRET de K48-diUb. A espécie de traste alto (vermelho colorido) corresponde a um estado compacto preexistente. b-d o estado compacto pode seletivamente ser enriquecido pelo Rpn13 completo, e o aumento da população pode ser cabido a um isotherm obrigatório. por exemplo, o estado compacto pode ser seletivamente enriquecido por Rpn13NTD, e o aumento da população pode ser ajustado para ser uma isoterma de ligação. h com os fluoróforos conjugados em locais N25C / N25C, Rpn13NTD pode enriquecer seletivamente o estado compacto preexistente do diUb distal de K48-tetraUb (cf. Suplementar Fig. S5), proporcionando uma afinidade de ligação. As populações dos smFRET espécies são calculados pela média de três medidas independentes, com os erros indicando 1 SD; os valores de KD são relatados como melhor ajuste ± montagem de erros

conformacional de flutuação de K48-diUb tenha sido previamente investigados usando smFRET26. Nesse estudo, os autores resolveram duas espécies de smFRET para K48-diUb, ou seja, espécies de alto traste e baixo traste com eficiência de traste central em 0,69 e 0,41, respectivamente, além de uma espécie SEM traste. Os autores mostraram que a titulação de um otub1 inativado (OTUB1i), uma deubiquitinase específica para K48 isopeptídeo linkage33, enriquece principalmente as espécies de baixo traste. Sua observação levou à proposta de que o K48-diUb pode ser especificamente reconhecido pelo OTUB1 por meio de um mecanismo de seleção conformacional. Aqui repetimos a titulação de smFRET e descobrimos que OTUB1i enriquece as espécies de traste médio(Fig. S3a-c). Além disso, o aumento populacional das espécies de traste médio na titulação de OTUB1i pode ser ajustado a uma isoterma de ligação com um valor KD de 7,7 ± 0.1 µM (Fig. S3d), que está próximo do valor KD reportado anteriormente26. Assim, as espécies de traste médio no presente estudo devem corresponder às espécies de traste baixo no estudo anterior, e a discrepância pode surgir de diferentes eficiências de contagem de fótons e rotinas de ajuste de traços de tempo smFRET.

para confirmar ainda mais que K48-diUb flutua entre três estados conformacionais preexistentes, introduzimos fluoróforos em pares adicionais de locais de conjugação de fluoróforos (Fig. S1b-d). Para os locais alternativos, embora as eficiências centrais das espécies de traste sejam diferentes,os perfis de smFRET ainda podem ser descritos como três espécies de traste sobrepostas com populações semelhantes (Fig. S4). Por exemplo, para os locais de conjugação de 25 C / 25 C, As espécies de alto, médio e baixo traste estão centradas em eficiências de traste de 0,68, 0,54 e 0,21, com respectivas populações de ~48%, ~43% e ~9% (Fig. S4d). Assim, é improvável que a conjugação dos fluoróforos perturbe a estrutura proteica, e as medições de smFRET revelaram a dinâmica conformacional inerente de K48-diUb independentemente do local de conjugação, ou seja, o K48-diUb alterna entre três estados distintos na ausência de uma proteína parceira.

para avaliar ainda mais se as subunidades Ub em cadeia UB ligada a K48 mais longa também flutuam entre vários estados conformacionais, analisamos o perfil smFRET de tetra-ubiquitina ligada a K48 (K48-tetraUb). Conjugamos os fluoróforos em dois locais N25C no diUb distal (com respeito ao diUb proximal) de K48-tetraUb. O perfil smFRET também pode ser ajustado como três espécies de traste sobrepostas (Fig. S5a). Embora as populações relativas das três espécies sejam diferentes das de um K48-diUb isolado com fluoróforos conjugados nos mesmos locais (Fig. S4d), as eficiências de traste Central das espécies de traste são quase idênticas. Assim, os Estados conformacionais da unidade diUb provavelmente são preservados em cadeia UB ligada a K48 mais longa, enquanto a diferença nas populações relativas pode ser resultado do efeito modulatório do diUb proximal.

a espécie de alto traste é seletivamente enriquecida por Rpn13

para avaliar a relação entre a dinâmica conformacional da cadeia UB ligada a K48 e o reconhecimento Rpn13, foi titulado K48-diUb marcado com fluoróforo de 150 pM com proteína Rpn13 humana de comprimento total. Curiosamente, após a adição de 100 nM Rpn13, as espécies de alto traste preexistentes de K48-diUb são enriquecidas de ~48% a ~57% (Fig. 1A, b), enquanto a população de espécies de traste médio e baixo diminui. A população de espécies de alto traste continua a aumentar com mais Rpn13 adicionado (Fig. 1C), e a isoterma de ligação pode ser ajustada a um valor KD de 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

foi demonstrado anteriormente que Rpn13NTD é o principal responsável pela binding6 Ub,7. Assim, realizamos titulação de smFRET para 150 pM fluorophore-rotulado K48-diUb usando apenas Rpn13NTD compreendendo apenas os primeiros 150 resíduos. Rpn13NTD também enriquece seletivamente as espécies de alto traste de K48-diUb (Fig. 1e, f). O aumento populacional de espécies de alto traste pode ser ajustado para pagar um valor KD de 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g), que é um aumento de cerca de 4 vezes na afinidade em comparação com Rpn13 de comprimento total. Se os fluoróforos estiverem ligados em locais de conjugação alternativos (Fig. S1B e S4b), a titulação de Rpn13NTD também causa o enriquecimento de espécies de traste equivalentes seguindo uma tendência semelhante, proporcionando valor KD quase idêntico (Fig. S6). Assim, a aparência de resíduos adicionais pode ter um pequeno efeito inibitório sobre a interação entre Rpn13NTD e K48-diUb.

além disso, realizamos titulação de smFRET para 150 pM K48-tetraUb com fluoróforos conjugados no diUb distal (Fig. S5a). A titulação de Rpn13NTD enriquece seletivamente as espécies de alto traste preexistentes do diUb distal marcado com fluoróforo (Fig. S5b-d), e a isoterma de ligação pode ser ajustada a um valor KD de 214 ± 70 nM (Fig. 1h). A redução de 7 vezes na afinidade de ligação em comparação com Rpn13NTD:interação K48-diUb pode ser atribuída à auto-associação entre diub distal e diub proximal34, tornando a superfície de ligação menos disponível para ligação Rpn13. É importante ressaltar que, para todas as titulações smFRET de K48-diUb ou K48-tetraUb, a eficiência Central das espécies de alto traste muda pouco na ausência ou presença de Rpn13 ou Rpn13NTD. Isso significa que Rpn13 se liga a uma conformação preexistente de K48-diUb por meio de um mecanismo de seleção conformacional, se K48-diUb é por si só ou parte de uma cadeia UB mais longa. Isso também significa que as espécies de alto traste, ou seja, o estado compacto preexistente de K48-diUb, não está totalmente fechado e está pronto para interagir com outras proteínas. É importante ressaltar que o enriquecimento seletivo das espécies de alto traste também indica que Rpn13 deve interagir com ambas as subunidades Ub ao mesmo tempo.

Rpn13 liga-se preferencialmente a diUb ligado a K48

para avaliar a especificidade de ligação Rpn13 para ligação K48, avaliamos as afinidades de ligação entre Rpn13 e outros tipos de proteínas Ub. Com a titulação de 200 nM Rpn13NTD em 150 pM fluorophore-rotulado K48-diUb, a população das espécies de alto traste aumenta em 15% de ~48% para ~63% (Fig. 1f). Nesta concentração, a ligação K48-diUb ainda não está saturada com Rpn13NTD (Fig. 1g) e, portanto, a população das espécies de alto traste é sensível a pequenas mudanças na concentração Rpn13NTD disponível. K48-diUb não rotulado pode competir pela ligação ao Rpn13NTD com K48-diUb rotulado com fluoróforo. Com a adição de 150 pM K48-diUb não rotulado, a população das espécies de alto traste diminui em 7,5%, correspondendo a uma inibição de 50% de Rpn13NTD-bound fluorophore-rotulado K48-diUb (Fig. 2a). Com a adição de 300 pM K48-diUb não rotulado, a população de espécies de alto traste diminui em 11%, totalizando um total de 73% de inibição (Fig. 2b). Como tal, tanto o K48-diUb marcado com fluoróforo quanto o não rotulado competem pela mesma interface de ligação no Rpn13 com afinidade de ligação semelhante. Isso também significa que a conjugação dos fluoróforos com K48-diUb causa pouca perturbação na interação entre Rpn13NTD e K48-diUb.

A, B adição de 200 nM Rpn13NTD primeiro enriquece as espécies de alto traste de K48-diUb rotulado com fluoróforo (cf. Figura 1f), e a adição adicional de 150 pM e 300 pM K48-diUb não rotulados diminuem a população das espécies de alto traste. C, D A adição de 150 pM e 300 pM monômero Ub não rotulado tem efeito insignificante na população das espécies de alto traste. e, f Adição de 150 pM K48-diUb e 150 pM M1-diUb causar redução muito pequena da população do alto-TRASTES espécies

Além disso, a mistura de 200 nM Rpn13NTD e 150 pM fluoróforo-rotulado K48-diUb, nós adicionamos sem nome Ub monômero, K63-vinculado diubiquitin ou M1-vinculado diubiquitin, para avaliar se a outros tipos de Ub pode deslocar K48-diUb. A população das espécies de alto traste muda pouco com a adição de 150 pM ou 300 pM UB monômero (Fig. 2c, d). Com a adição de 150 PM K63-diUb e 150 pM M1-diUb, a população das espécies de alto traste também permanece inalterada dentro da faixa de erro (Fig. 2e, f). Por outro lado, a titulação direta de 1 µM Rpn13NTD em K63-diUb conjugado com fluoróforo E M1-diUb causa pouca mudança em seus perfis de smFRET preexistentes (Fig. S7). Juntos, Rpn13NTD interage seletivamente com K48-diUb.

estrutura da solução de Rpn13NTD:K48-diUb complexo

Apesar de ter mostrado agora Rpn13NTD interage seletivamente com K48-diUb, apenas a estrutura complexa entre Rpn13NTD e Ub monômero foi determined6,8. Para entender como as duas subunidades em K48-diUb podem interagir simultaneamente com Rpn13NTD, partimos para determinar a estrutura da solução do complexo Rpn13NTD:K48-diUb usando ressonância magnética nuclear (NMR). Após a formação do complexo proteico, os resíduos interfaciais experimentariam diferentes ambientes locais e, portanto, exibiriam sinais de RMN. Descobrimos que, titularizar K48-diUb não rotulado para 15N-rotulado Rpn13 causa grandes perturbações de deslocamento químico (CSPs), que envolvem principalmente resíduos 73-83 e 93-106 (Fig. 3a). Esses resíduos formam uma superfície contígua no Rpn13, cobrindo uma área maior do que o esperado da estrutura complexa previamente determinada entre o rpn13ntd e o monômero UB6,7. Por outro lado, titulando Rpn13NTD não rotulado para K48-dUb, com UB proximal ou distal 15N rotulado e a outra subunidade não rotulada, os CSPs são observados principalmente para resíduos na região da folha β de ambas as subunidades Ub. Alguns dos resíduos interfaciais também desapareceram após a formação do complexo (Fig. 3b, c).

A-c CSP teve uma média de mais de 1h e 15N dimensões de prótons de amida de espinha dorsal após a formação do complexo com proteínas marcadas com isótopos de 0,2 mM e não rotuladas. Inserções: a subunidade marcada com 15N é ilustrada com representação de superfície, e os resíduos de cor vermelha têm CSPs acima da linha pontilhada. d, e com uma sonda paramagnética conjugada no local E24C do UB distal, as razões de intensidade entre os espectros paramagnéticos e diamagnéticos e os valores pré Γ2 foram avaliados para prótons de amida de backbone de Rpn13NTD rotulados como 15N. Caixas cinzentas indicavam resíduos com PREs intermoleculares muito grandes. f com a sonda paramagnética conjugada no local N25C do UB proximal, os valores de Γ2 foram medidos para prótons de amida de Ub distal marcado com 15N em K48-diUb. As barras de erro indicam 1 S. D. e resíduos completamente ampliou no complexo de são identificados com estrelas

Nuclear Overhauser effect (NOE) relata a distância relacionamento (<6 Å) entre os núcleos. Além disso, o experimento de RMN semi-filtrado 13C pode fornecer NOE entre próton ligado a 12c e próton ligado a 13C, ou seja, relação de distância intermolecular. Obtivemos NOEs intermoleculares entre Rpn13NTD e UB proximal, entre Rpn13NTD e UB distal, e entre UB proximal e UB distal (Fig. S8). Além disso, conjugamos uma sonda paramagnética maleimida-EDTA-Mn2 + no local e24c da Ub distal e coletamos realce de relaxamento paramagnético (PRE) para prótons de amida de espinha dorsal de Rpn13NTD, seguindo o protocolo estabelecido22,35. Conforme avaliado pela razão de intensidade de pico dos espectros paramagnéticos versus diamagnéticos ou pela taxa Γ2 de realce de relaxamento transversal, os resíduos Rpn13 30-42 e 101-106 experimentam grandes PREs com alargamento severo da linha (Fig. 3d, e). Também conjugamos a sonda paramagnética no local N25C da Ub proximal e avaliamos a taxa de realce de relaxamento transversal Γ2 para a UB distal (Fig. 3f). Grandes valores pré são observados entre as duas subunidades Ub do K48-diUb livre de ligante, e a adição de Rpn13NTD aumenta as PREs inter-Ub, mas com um perfil pré semelhante. Os experimentos pré-RMN confirmam assim que Rpn13NTD enriquece o estado compacto preexistente de K48-diUb.

para refinar o Rpn13NTD:Estrutura complexa K48-diUb contra restrições experimentais, realizamos ancoragem rígida do corpo com liberdade de ângulo de torção dada aos resíduos do linker diUb e às cadeias laterais de resíduos interfaciais. Para os 20 conformadores de energia mais baixa, o desvio do quadrado médio da raiz (RMS) para átomos pesados de backbone de todos os resíduos rígidos é de 0,86 ± 0,54 Å (Fig suplementar. S9 e tabela S1). As duas subunidades Ub de K48-diUb permanecem associadas ao complexo, enterrando a área de superfície Acessível a solventes (SASA) de ~1130 Å2. Por outro lado, rpn13ntd Cunha, enterrando ~940 Å2 de SASA com o UB proximal e ~1300 Å2 de SASA com o UB distal (Fig. 4a). A estrutura complexa entre Rpn13NTD e proximal Ub de K48-diUb no presente estudo é semelhante ao conhecido estrutura complexa entre Rpn13NTD e Ub monomer6,7, com o RMS diferença para backbone de átomos pesados 2.17 ± 0.31 Å (Complementar Fig. S10a). Curiosamente, embora os resíduos hidrofóbicos L8, I44 e V70 na Ub proximal estejam envolvidos para interagir com Rpn13, os mesmos três resíduos na UB distal estão enterrados na interface Ub-Ub.

uma Estrutura de Rpn13NTD:K48-diUb complexo. A formação do complexo enterra interfaces extensas entre as subunidades. B superfícies potenciais eletrostáticas de Rpn13NTD e UB distal de K48-diUb, desenhadas na escala de ± 3 kBT. Os resíduos R104 em Rpn13NTD e D39 em UB distal são mostrados como bolas e paus. c r104e mutação de reversão de carga em Rpn13NTD causa uma diminuição de 300 vezes na afinidade de ligação para K48-diUb, conforme avaliado por smFRET (cf. Suplementar Fig. S11). O valor KD é relatado como melhor ajuste ± erros de encaixe. as análises de D Western blot mostram que a transfecção do mutante Rpn13 r104e (com um sinalizador N-terminal) aumenta a quantidade total de proteínas poliub ligadas a K48 na célula. as viabilidades das células e após choque térmico (em relação às células sem choque térmico) mostram que a transfecção do mutante Rpn13 r104e, mas não do tipo selvagem Rpn13, confere termotolerância. * P < 0, 05, ***P < 0.001, para controlar células de um mesmo grupo, teste t não pareado; ##P < 0.01, ###P < 0.001, para o não tratamento de células com choque térmico, ANOVA one-way; &&P < 0.01, &&&P < 0.001, para o tipo selvagem Rpn13 transfected células com choque térmico, ANOVA one-way

O Rpn13NTD:K48-diUb estrutura complexa também pode ser corroborado por uma única molécula de TRASTE de dados. Com base na estrutura complexa, modelamos os fluoróforos em seus locais de conjugação em K48-diUb. A distância média é de 43,2 ± 5.8 Å entre os centros geométricos dos anéis aromáticos fluoróforos, o que corresponde a uma eficiência teórica de traste de 0,73 ± 0,13 (Fig. S10b). Este valor é quase o mesmo que a eficiência Central observada para as espécies de alto traste (Fig. 1a).

Rompimento de Rpn13NTD: distal Ub interação faz com que a acumulação de ubiquitinated proteínas na célula

Na estrutura complexa entre Rpn13NTD e K48-diUb, a interação entre Rpn13NTD e proximal Ub é semelhante à que entre Rpn13NTD e Ub monômero, como relatado anteriormente (Complementar Fig. S10a). Assim, projetamos experimentos para avaliar a importância funcional para a interação entre Rpn13NTD e o UB distal de K48-diUb. Muitos resíduos carregados estão localizados na interface entre Rpn13NTD e o UB distal de K48-diUb e, portanto, a força eletrostática Pode desempenhar um papel importante para estabilizar o complexo (Fig. 4b). Entre eles, o resíduo D39 na Ub distal está próximo do resíduo R104 na Rpn13. Assim, mudamos o resíduo Rpn13 R104 para um glutamato e titulamos o mutante Rpn13NTD para K48-diUb marcado com fluoróforo. A proteína mutante enriquece as espécies de alto traste de K48-diUb (Fig. S11). No entanto, a afinidade de Ligação torna-se muito mais fraca. A isoterma de ligação pode ser ajustada a um valor KD de 10,0 ± 3,3 µM, cerca de 300 vezes mais fraco que o tipo selvagem Rpn13NTD (Fig. 4c). Como tal, a associação com a Ub distal é importante para o reconhecimento específico entre Rpn13 e K48-diUb.

a diminuição da afinidade de ligação do mutante r104e nos permitiu avaliar a importância funcional da interação entre a cadeia UB ligada a Rpn13 e K48. A transfecção transitória do tipo selvagem Rpn13 aumenta ligeiramente a quantidade de proteínas poliub ligadas a K48 (Fig. 4d). É possível que, após a Rpn13 transfection, um montante de excesso de livre Rpn13 competir para a ligação com o K48-vinculado polyUb proteínas com proteassoma associados Rpn13, tornando assim o recrutamento de ubiquitinated substrato de proteínas para o proteassoma menos eficiente. Por outro lado, a transfecção do mutante Rpn13 r104e aumenta muito a quantidade de proteínas poliub ligadas a K48, em comparação com as células transfectadas com o tipo selvagem Rpn13 (Fig. 4d). Como controle positivo, incubamos as células com 1 µM MG132, um potente inibidor do proteassoma 36. Devido ao bloqueio da degradação de proteínas lábeis, a adição de MG132 aumenta significativamente a quantidade de proteínas poliub ligadas a K48. Tomados em conjunto, a mutação R104e de Rpn13 pode levar ao acúmulo de proteínas de substrato ubiquitinado. Isso pode ser atribuído à interação mais fraca entre o mutante Rpn13 associado ao proteassoma e K48-diUb e K48-poyUb.

choque térmico pode diminuir a viabilidade celular. Descobrimos que o choque térmico de 30 minutos a 43 °C pode diminuir a viabilidade das células HEK293 para 75%. Semelhante aos relatórios anteriores36,37, também descobrimos que o tratamento de MG132 tem um efeito protetor na sobrevivência celular após choque térmico, com a viabilidade celular diminuída para ~90% (Fig. 4e). Isso ocorre porque MG132 inibe a degradação proteassomal, tornando as proteínas de choque térmico de vida curta mais disponíveis (Fig. 4d). Também avaliamos a viabilidade de células em choque térmico transfectadas com Wildtype Rpn13 e não encontramos diferença significativa das células de controle sem transfecção Rpn13. Por outro lado, a viabilidade celular das células transfectadas Rpn13 R104E diminuiu para ~83% após choque térmico, que é significativamente maior do que a das células de controle e células transfectadas com tipo selvagem Rpn13 (Fig. 4e). Isso implica que o mutante Rpn13 tem um efeito protetor na sobrevivência celular após choque térmico, semelhante ao efeito de MG132. Em conjunto, a interação entre a cadeia UB ligada a Rpn13 e K48 é essencial para o reconhecimento mediado por Rpn13 de proteínas de substrato ubiquitinado pelo proteassoma, enquanto uma mutação de ponto interfacial em Rpn13 pode causar acúmulo de certas proteínas de substrato, como proteínas de choque térmico, e conferir termotolerância às células transfectadas.

Rpn13NTD:a interação K48-diUb pode ser direcionada para modular a função Rpn13

Rpn13 é recrutada dinamicamente para o proteassoma por meio da interação entre Rpn13NTD e a cauda do Terminal C De Rpn27,13. A estrutura complexa aqui indica que a interface de ligação em Rpn13NTD para Rpn2 está próxima, mas não se sobrepõe à interface de ligação para o UB distal de K48-diUb (Fig. 5a). Nós, portanto, pré-misturado a última 16 resíduos de Rpn2 (Rpn2CTD) com Rpn13NTD ou com comprimento total Rpn13 na proporção de 1:1, e titulada Rpn13NTD:Rpn2CTD complexo para fluoróforo-rotulado K48-diUb. A pré-mistura de Rpn2CTD aumentou o valor KD de Rpn13NTD: K48-diUb de 33,1 ± 6,9 nM (Figs. 1g) a 66,8 ± 13,9 nM (Fig suplementar. S12a-c e Fig. 5B), enquanto diminuiu o valor KD de Rpn13: K48-diUb de 119 ± 24 nM (Figs. 1D) a 43,9 ± 12,8 nM (Fig. S12d-f E Fig. 5c). Assim, fornecendo as incertezas de medição, a associação de Rpn2CTD causa apenas pequena perturbação para a afinidade de ligação entre Rpn13 e K48-diUb, o que também pode ter a ver com a presença de vinculador e o domínio C-terminal de Rpn13.

a a superfície de ligação do UB distal de K48-diUb em Rpn13NTD é adjacente à superfície de ligação de Rpn2CTD. Com Rpn13NTD-Rpn2CTD estrutura complexa (código PDB 5V1Y) sobreposta por Rpn13NTD, Rpn2CTD é mostrado como desenho animado vermelho. O resíduo Rpn13 K34 está próximo do Terminal C do UB distal (mostrado como uma linha pontilhada). as afinidades de ligação B, c foram obtidas a partir de titulações smFRET de rpn13ntd equimolar:Rpn2CTD ou Rpn13: Rpn2CTD para K48-diUb marcado com fluoróforo. Os valores de KD são relatados como melhor ajuste ± erros de ajuste. D A ligação do monômero UB ancorado em Rpn2 provavelmente ocupa a mesma superfície de ligação do UB distal, causando o deslocamento deste último. e, f A smFRET concorrência experimentos, com adição de 150 pM Rpn2CTD-Ub proteína de fusão, a mistura de 200 nM Rpn13NTD ou full-length Rpn13 e 150 pM fluoróforo-rotulado K48-diUb (c.f. Figura 1c e f). O erro indica 1 S. D. a partir de três medições independentes das populações das espécies smFRET

Rpn2 e distal Ub de K48-diUb ocupam superfícies próximas no Rpn13NTD. Portanto, uma proteína de fusão com monômero Ub anexada no Terminal C De Rpn2CTD pode se projetar para fora e interferir na interação entre Rpn13NTD com o UB distal de K48-diUb (Fig. 5d). Como mostramos, a adição de 200 nM Rpn13NTD aumenta a população das espécies de alto traste de 150 pM fluorophore-rotulado K48-diUb para ~63% (Fig. 1F), enquanto a adição de monômero Ub não pode competir pela ligação Rpn13NTD (Fig. 2c, d). Quando adicionamos mais 150 PM proteína de fusão Rpn2CTD-Ub não rotulada, a população de espécies de alto traste diminui em ~4% a ~59% (Fig. 5e). Por outro lado, mostramos que, a adição de 200 nM de comprimento total Rpn13 aumenta a população das espécies de alto traste de 150 pM fluoróforo-rotulado K48-diUb para ~60% (Fig. 1c). A adição adicional de 150 pM de proteína de fusão Rpn2CTD-Ub não rotulada diminui a população de espécies de alto traste em ~4,5 a ~55,5% (Fig. 5f). Observe que anexar um Ub em Rpn2CTD quase não tem efeito na interação entre Rpn2CTD e Rpn13NTD (Fig. S13). Assim, nossos dados indicam que as interfaces de ligação Rpn2 e K48-diUb no Rpn13NTD estão próximas umas das outras. Mais importante ainda, o UB ancorado em Rpn2 pode bloquear fisicamente o acesso do diUb distal ao Rpn13 e enfraquecer a interação entre K48-diUb e Rpn13.