Usando o DBE técnica, temos sistematicamente coletadas biópsias de todo o ser humano trato intestinal e caracteriza a distribuição de enteroendocrine K e L células e a expressão de sua hormonal produtos em indivíduos saudáveis e indivíduos com diabetes tipo 2.
Como diabetes tipo 2 implica excesso de peso/obesidade e disfunções homeostase da glicose que poderia correlacionar as alterações no enteroendocrine K e L células, o estudo foi desenhado para descrever o padrão de distribuição destas células e a expressão de alguns de seus produtos em dois, prospectivamente, recrutados, de tamanho semelhante, bem definidos e de correspondência de grupos de voluntários, sem qualquer conhecidos distúrbios gastrointestinais. Usando o DBE, foi possível obter um grande número de amostras em todo o trato intestinal: de nove regiões anatomicamente específicas (Fig. 1) e 7-22 ‘estações’ ao longo do jejuno e íleo. As biópsias das áreas anatomicamente bem definidas foram altamente comparáveis. Existe maior incerteza em relação aos locais de biópsia no jejuno e íleo proximal (locais de biópsia 3-9, Fig. 1) devido ao comprimento variável da intubação e, portanto, ao número de amostras obtidas entre os indivíduos. Para lidar com essa questão, dividimos sistematicamente o jejuno e o íleo em sete regiões (ver Métodos). A marca de tinta submucosa colocada na profundidade máxima de inserção durante a enteroscopia anterógrada foi observada durante a enteroscopia retrógrada em quatro dos 24 indivíduos, indicando enteroscopia total (Fig. 2). Supõe-se que a maioria do trato intestinal foi investigada no restante dos Participantes, conforme julgado pelo comprimento da intubação alcançada (para detalhes, consulte nosso artigo metodológico ).
utilizamos imunohistoquímica e contagem de células para quantificar as células enteroendócrinas e enzimas de processamento de prohormônios, e análise de expressão de mRNA qPCR para avaliar os produtos hormonais/enzimáticos. Ambos os métodos estão bem estabelecidos, mas também apresentam limitações. Uma alta especificidade de anticorpos usados na imunohistoquímica é de grande importância para garantir um mínimo de coloração inespecífica (falsos positivos). Assim, escolhemos anticorpos bem estabelecidos e bem caracterizados . Usando imunohistoquímica e contagem de células de microfotografias de biópsias fatiadas, objetos tridimensionais (ou seja, células enteroendócrinas) são avaliados com uma técnica de imagem bidimensional. Uma técnica mais ideal para avaliação da distribuição celular seria a estereologia, na qual a densidade verdadeira (ou seja, células/tecido mm3) é estimada . No entanto, essa técnica exigiria “blocos” transversais completos de tecido, o que é incompatível com o alto número de locais de biópsia e, portanto, mapeamento detalhado do trato intestinal em humanos vivos que foi destinado no presente estudo. Além disso, o seguinte deve ser levado em consideração. Primeiro, a avaliação da expressão de mRNA indica a atividade das células endócrinas, mas não fornece uma medida da produção total de um determinado produto celular, pois nem todo mRNA é traduzido em um produto ativo final. Em segundo lugar, a expressão é relativa, uma vez que os transcritos específicos do mRNA estão sendo relacionados à expressão de um gene expresso de forma estável (consulte Métodos ESM para obter mais detalhes). Considerando a heterogeneidade biológica do diabetes tipo 2, diferenças mais pronunciadas poderiam ter sido detectadas com um maior tamanho de amostra e inclusão de pacientes com desregulação de glicose mais extensa.
o trabalho de Sjölund et al de 1983 sobre a distribuição de células enteroendócrinas é o mais detalhado realizado no intestino humano até agora usando IHS com uma ampla gama de anti-soros (25 tipos) contra peptídeos neuro-hormonais intestinais conhecidos ou propostos . Técnicas minimamente invasivas não estavam disponíveis naquela época. Assim, as amostras foram recuperadas de apenas sete regiões: duodeno proximal e distal, jejuno médio, íleo distal, cólon ascendente, parte distal do cólon transverso ou cólon sigmóide e reto. Para cada região, o material tecidual foi obtido de 9 a 17 indivíduos. As amostras foram obtidas durante a cirurgia abdominal (realizada principalmente devido à malignidade) ou durante enteroscopic exames envolvendo biópsias em indivíduos com “outros distúrbios gastrointestinais”, incluindo uma variedade de não-especificado sintomas e doenças (e.g. ‘hemorragias ocultas’ e ‘doença do fígado’). Em 1985, Adrian et al usaram uma técnica de radioimunoensaio para determinar a quantidade de PYY no fundo gástrico e antro, duodeno, jejuno, íleo, cólon ascendente, cólon sigmóide e reto . Amostras de cada local foram obtidas de 5 a 8 indivíduos submetidos à cirurgia devido a carcinoma ou úlceras gástricas. Em 1992, um estudo investigando a distribuição de células l enteroendócrinas em humanos foi relatado por Eissele et al . As amostras foram obtidas de sete regiões: duodeno, jejuno proximal e distal, íleo, cólon ascendente, cólon transverso e reto. As amostras foram obtidas de apenas cinco participantes submetidos à cirurgia para carcinoma ou doença de Crohn. Em 2005, Guedes et al investigaram a distribuição de células GIP-, GLP-1 – e CGA-positivas, respectivamente, usando IHS em amostras de cada 20 cm do intestino delgado em 30 cadáveres humanos .
deve-se enfatizar que os quatro estudos mencionados acima investigaram amostras de tecido de aparência normal sem sinais de alterações patológicas. No entanto, a presença de alterações malignas ou inflamatórias na área intestinal ou o início rápido da degradação celular post mortem poderia ter influenciado a distribuição e função celular enteroendócrina geral. Além disso, a heterogeneidade dos participantes pode ter influenciado os resultados.
Em acordo com nossos resultados, Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al e Guedes et al, respectivamente, descritos variação em células L produtos (GLP-1 e/ou PYY), dependendo do intestino localização, com uma densidade superior/quantidade na porção distal jejuno e o íleo, em comparação com o duodeno e jejuno proximal , e um aumento da densidade/quantidade de proximal para distal do cólon, com os mais altos níveis no reto . Nossos resultados suportam esse padrão de distribuição de células L em indivíduos saudáveis e no diabetes tipo 2, com aumento da expressão gênica GCG e PYY, bem como aumento da densidade de células GLP-1 e PIY-positivas, ao longo do intestino delgado e ao longo do cólon. Também observamos o maior sinal de marcadores de células L (células positivas para PYY e GLP-1 e expressão de mRNA PYY) no reto, exceto pela expressão de GCG. As implicações-se houver-das diferenças observadas entre os grupos (expressão significativamente maior de GCG e PYY no cólon de participantes com diabetes tipo 2 em comparação com indivíduos saudáveis) são atualmente desconhecidas. Está bem estabelecido que o efeito incretina é reduzido no diabetes tipo 2, e foi proposto que um defeito na secreção de GLP-1 induzida por nutrientes pode contribuir para explicar esse fenômeno. No entanto, estudos que investigam respostas de GLP-1 a estímulos nutricionais em pessoas com diabetes tipo 2 e indivíduos não diabéticos mostraram que, em geral, indivíduos com diabetes tipo 2 não apresentam respostas plasmáticas totais reduzidas de GLP-1 .
observamos uma discrepância entre os níveis de expressão de GCG e a densidade de células GLP-1-positivas ao longo do intestino. Isso enfatiza que L células em uma parte do intestino delgado pode se comportar de maneira diferente a partir de enteroendocrine L células em outra parte do intestino delgado, como sugerido por Svendsen et al., que observaram que o padrão de secreção de células L alterações ao longo do trato gastrointestinal, em ratos, por exemplo, que a L células secretam diferentes proporções de PYY e GLP-1, com algumas segregar apenas GLP-1 . De acordo com esses achados, é provável que as células l Mais localizadas distalmente expressem o proglucagon em uma extensão maior do que as células l Mais localizadas proximalmente.
nossos achados de maior expressão de GIP e densidade de células positivas para GIP na parte proximal do intestino delgado, ambos diminuindo distalmente para a região ileocecal em indivíduos saudáveis e aqueles com diabetes tipo 2, estão de acordo com os achados anteriores . Ao contrário de Sjölund et al , que descobriram que as células GIP-positivas estavam ausentes do intestino grosso, fomos capazes de detectar baixos níveis de células GIP-positivas na parte distal do trato intestinal. No entanto, não podemos descartar que isso seja resultado da ligação inespecífica de anticorpos. No entanto, observamos expressão de mRNA de GIP no cólon de ambos os grupos, embora em níveis muito baixos. A expressão de GIP foi significativamente maior em indivíduos com diabetes tipo 2 ao longo de todo o trato intestinal. Pode-se especular que a transcrição do GIP é aumentada como resultado compensatório da resistência do GIP, ou seja, o efeito insulinotrópico reduzido do GIP observado em indivíduos com diabetes tipo 2 . Em consonância com isso, os níveis de GIP em jejum demonstraram ser mais altos em participantes com diabetes tipo 2 em comparação com participantes de controle não diabéticos e , além disso, foi proposto que o GIP contribui para a hiperglicemia observada no diabetes tipo 2 (principalmente devido ao efeito glucagonotrópico do GIP) . No entanto, os dados referentes GIP respostas seguinte oral de glicose ou misto refeições em indivíduos com diabetes tipo 2 têm sido inconsistentes, e uma revisão sistemática com meta-análise sugere que o pós-prandial GIP respostas são semelhantes em pessoas com diabetes tipo 2 e indivíduos saudáveis .
dado que a glicoproteína ácida CgA é um componente das vesículas celulares e considerada como desempenhando múltiplos papéis no processo secretor de produtos endócrinos, é usada como um marcador geral de células enteroendócrinas . Ao contrário de Guedes et al, que observaram uma densidade constante de células CGA-positivas ao longo do intestino delgado, nosso estudo mostrou um declínio significativo. Além disso, observamos uma maior densidade de células CGA-positivas no intestino delgado de indivíduos saudáveis do que os participantes com diabetes tipo 2. Pode-se especular que o número total de células positivas para CgA (células enteroendócrinas) é alterado no diabetes tipo 2—Seja como conseqüência do estado diabético tipo 2 ou, talvez, contribuindo para a patogênese do diabetes tipo 2. Observamos um número bastante alto de células CGA-positivas no reto de ambos os grupos. Recentemente, Engelstoft et al mostraram em camundongos que a CgA foi localizada principalmente em células enteroendócrinas secretoras de monoamina e mais escassamente em células enteroendócrinas secretoras de peptídeos , talvez apoiando a proposta de Sjölund et al de que as células enteroendócrinas retais poderiam ter uma função principalmente local (parácrina) em vez de função sistêmica .
como o PC1/3 é conhecido por processar prohormones levando à formação de GIP e GLP-1, respectivamente, esperávamos encontrar a presença de PC1/3 ao longo de todo o trato intestinal. Observamos, respectivamente, uma discrepância envolvendo maior expressão de PCSK1 / 3 e menores densidades de células PC1/3 positivas no intestino delgado de participantes com diabetes tipo 2 em comparação com participantes saudáveis. Conforme descrito acima, esse achado deve ser interpretado com a visão de que algumas células enteroendócrinas podem ser muito ativas em algumas regiões e ter baixa atividade em outras regiões.
como o PC2 é conhecido principalmente pelo processamento de proglucagon para glucagon em células alfa pancreáticas, foi interessante Encontrar a expressão de mRNA de células pcsk2 e PC2-positivas ao longo de todo o trato intestinal. Isso pode indicar que o glucagon é produzido no intestino, como recentemente sugerido por Lund et al . Em consonância com isso, pode-se especular que a maior expressão de PCSK2 no intestino delgado de indivíduos com diabetes tipo 2 leva à formação de excesso de glucagon, contribuindo para a hiperglucagonemia diabética tipo 2. Para esclarecer ainda mais esse aspecto, estudos incluindo a dupla coloração imunohistoquímica são justificados.
Em conclusão, o presente mapeamento da distribuição da enteroendocrine K e L células e as variações observadas nos níveis de expressão de seus produtos relacionados, junto a humano trato intestinal, combinado com o demonstrou diferenças entre os participantes com diabetes tipo 2 e indivíduos saudáveis, fornecer um trabalho de referência para cientistas e clínicos. Combinado com o conhecimento de estudos fisiológicos sobre hormônios intestinais circulantes, nossos dados podem ser valiosos para entender como o intestino contribui para regular o metabolismo e o apetite da glicose. A identificação de PC2 em células enteroendócrinas é interessante porque isso pode ser consistente com a formação de glucagon no intestino humano. No entanto, mais estudos são necessários para provar essa possibilidade e vincular nossos achados à fisiopatologia do diabetes tipo 2.
