Funcional, Avaliação de Perfil de Lactobacillus fermentum TCUESC01: UMA Potencial Nova Cepa Probiótica Isolado durante a Fermentação de Cacau

Resumo

O uso intestinal de bactérias probióticas é muito comum na indústria de alimentos e tem sido o foco da maioria das pesquisas neste campo. No entanto, nos últimos anos, a pesquisa sobre microrganismos extraintestinais aumentou muito devido ao seu conhecido potencial como probióticos. Assim, Estudamos uma cepa de Lactobacillus fermentum (TCUESC01) extraída da fermentação do cacau. Primeiro, examinamos o impacto do pH no crescimento dessa cepa e estudamos sua sobrevivência em condições semelhantes às do trato gastrointestinal humano. L. fermentum TCUESC01 demonstrou resistência a condições que imitam o estômago e os intestinos humanos e cresceu bem entre pH 5 e pH 7. Em seguida, submetemos L. fermentum TCUESC01 ao armazenamento a 4°C em uma solução de leite e descobrimos que sobreviveu bem por 28 dias. Por fim, medimos a suscetibilidade dessa cepa a numerosos antibióticos e sua tendência a autoagregar. L. fermentum TCUESC01 mostrou autoagregação significativa, bem como suscetibilidade à maioria dos antibióticos testados. No geral, nossas descobertas apoiam o uso potencial dessa bactéria extraintestinal como probiótico dietético.

1. Introdução

a busca por novos probióticos é motivada pelo conhecimento de que cada cepa de microrganismos possui propriedades diferentes e pode ter efeitos únicos na saúde humana. Historicamente, acreditava-se que as bactérias lácticas em produtos probióticos tinham que ser provenientes de humanos devido à especificidade do hospedeiro . No entanto, microrganismos extraintestinais isolados de alimentos fermentados contendo lactose ou vegetais fermentados também apresentam efeitos probióticos promissores . Evidências preliminares de nosso laboratório indicam que as cepas de Lactobacillus derivadas da fermentação de cacau de alta qualidade exibem propriedades probióticas: reduzem os danos histológicos, reduzem a concentração sistêmica de citocinas inflamatórias e aumentam os níveis séricos de IgA em um modelo experimental in vivo de colite . No entanto, o possível uso dessas cepas em produtos comerciais depende de uma série de testes recomendados por organizações internacionais. De acordo com a Organização das Nações Unidas para Agricultura e alimentação (FAO) e a Organização Mundial da Saúde (OMS), as cepas probióticas potenciais devem ser avaliadas por suas características funcionais e tecnológicas, incluindo sua resistência durante o trânsito gastrointestinal e sua estabilidade durante o armazenamento . Portanto, avaliamos as propriedades funcionais e a segurança da cepa Lactobacillus fermentum TCUESC01 que foi isolada durante a fermentação de cacau de alta qualidade.

2. Materiais e métodos

2.1. Microrganismos e Condições de Crescimento

Lactobacillus fermentum TCUESC01 tensão (adesão número KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) foi cultivada em lactobacilos caldo MRS (1% de peptona, de 0,8%, extractos de carne, de 0,4%, extrato de levedura, 2% glycose, 0,5% de acetato de sódio, de 0,2% dipotássico hidrogenofosfato, de 0,02% de sulfato de magnésio heptaidratado, 0.005% sulfato de manganês Tetra-hidratado e 0,02% ácido cítrico triamônio sal) (HIMEDIA®, Índia) por 18 h a 37°C e armazenado a -80°C em uma solução de leite a 10% (Molico®, Brasil) contendo 30% de glicerol.

2.2. A análise de crescimento e Viabilidade sob pH variado

soluções de caldo MRS de pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 e pH 9 foram preparadas pela adição de 1 mol·L−1 de ácido clorídrico ou 1 mol·L−1 de hidróxido de sódio. Antes do ensaio, l. fermentum TCUESC01 foi cultivado por 18 h E depois diluído em solução salina (0.85% de cloreto de sódio) a uma densidade óptica (OD) de 0,3 medida a 600 nm (OD600 = 0,3). Os ensaios foram realizados em microplacas de 96 poços (Costar®), em que 180 µL de MRS em cada pH foram inoculados com 20 µL de cultura ativa ou solução salina como controle. A microplaca foi incubada a 37°C e a OD a 600 nm foi determinada a cada hora por 10 h usando um espectrofotômetro (Molecular Devices®, Versamax tunable microplate reader). Paralelamente, as amostras foram colhidas a cada hora de cada pH, chapeadas em ágar MRS, e incubadas em condições anaeróbias a 37°C para testar a viabilidade celular.

2.3. Tolerância in Vitro a condições gastrointestinais

as bactérias foram cultivadas a 37°C durante a noite em 40 mL de caldo MRS, lavadas em solução salina e inoculadas em 20 mL de uma solução de leite a 10%. A fermentação do leite foi permitida até que um pH de 4,5 fosse atingido, momento em que as bactérias foram contadas (CFU·mL−1) por diluição em série e revestimento em ágar MRS. Além disso, uma diluição em série foi feita em solução salina (pH 2,5) com pepsina (3 g/L), seguida de incubação a 37°C por 1,5 h. As bactérias foram lavadas por dois ciclos de centrifugação (5000 ×g/10 min) e ressuspensão em solução salina, antes de serem ressuspendidas em 20 mL de bile suína a 1% a pH 8,0 (Merck®, Alemanha) e incubadas a 37°C por 45 minutos. As contagens bacterianas (UFC * mL-1) foram determinadas pelo revestimento da solução bacteriana em ágar MRS em condições anaeróbicas a 37°C por 48 h após cada fase de incubação.

2.4. Sobrevivência durante o armazenamento a frio em leite acidificado

a estirpe L. fermentum TCUESC01 foi cultivada em caldo MRS e depois colhida por centrifugação (5000 ×g/10 min). As bactérias foram então lavadas por ressuspensão em solução salina e novamente peletizadas por centrifugação. As culturas foram inoculadas em uma solução estéril de 10% de leite desnatado acidificado a pH 4,5 com ácido láctico (Synth®, Brasil). A solução láctica foi refrigerada a 4 ° C e as unidades formadoras de colônias (UFC·mL-1) foram contadas por diluição em série E Revestimento em ágar MRS em 0, 7, 14, 21 e 28 dias. A viabilidade da cepa foi determinada em relação ao ponto de tempo zero, que foi considerado como tendo 100% de sobrevida.

2.5. Análise de Autoaggregation

L. fermentum TCUESC01 foi cultivadas em 20 mL de caldo MRS durante a noite a 37°C. O pellet bacteriano foi coletado e suspensão em solução salina para uma OD de 0,3 a 600 nm (OD600 = 0.3). A capacidade de L. fermentum TCUESC01 para autoagregação foi testada incubando a suspensão a 37°C e o OD foi monitorado por hora por 5 h. a agregação percentual () foi calculada da seguinte forma: Onde está a densidade óptica inicial no ponto de tempo zero e é a densidade óptica no momento da medição. Os resultados apresentados foram as médias mais / menos os desvios padrão de três experimentos.

2.6. O teste de suscetibilidade aos antibióticos

l. fermentum TCUESC01 foi cultivado por 18 h em caldo MRS a 37°C e diluído para 0,5 na escala de McFarland em solução salina. Os discos antibióticos foram colocados em placas de ágar Mueller-Hinton que foram então inoculadas com 100 µL da suspensão de bactérias ativas. As placas foram então incubadas em condições anaeróbicas por 24 h a 37°C. As zonas de inibição ao redor dos discos foram medidas e as bactérias foram classificadas como resistentes (), moderadamente suscetíveis (MS) ou suscetíveis () com base nos padrões descritos na Tabela 1. O antibiótico de discos utilizados no teste de sensibilidade foram a amoxicilina (AMO, LABORCLIN®, Brasil, 10 µg), ciprofloxacina (CIP, LABORCLIN, Brasil, 5 µg), amicacina (AMI, CECON®, Brasil, 30 µg), azitromicina (AZI, CECON, Brasil, 15 µg), amoxicilina e ácido clavulânico (AMC, SENSIFAR®, Brasil, 30 µg), norfloxacina (NOR, LABORCLIN, Brasil, 10 µg), sulfonamida (SUL, NEWPROV®, no Brasil, 300 µg), a vancomicina (VAN, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), estreptomicina (EST, LABORCLIN, Brasil, 10 µg), eritromicina (ERI, CECON, Brasil, 15 µg), tetraciclina (TET, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brasil, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brasil, 30 µg), gentamicina (GEN, CECON, Brasil, 10 µg), cefotaxima (CTX, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), cotrimoxazol (trimetoprim e sulfametoxazol) (SUT, SENSIFAR, Brasil, 25 µg), cloranfenicol (COÁGULOS, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), clindamicina (CLI, CECON, Brasil, 2 µg), penicilina G (PEN10, CECON, Brasil, 10 µg), e cefoxitina (CFO, LABORCLIN, Brasil, 30 µg).

2.7. Análises estatísticas

os cálculos de médias e desvios-padrão, as análises de variância, os testes de comparação múltipla de Tukey e todas as análises estatísticas foram feitas usando o programa de software GraphPad® Prism 5.0. Todos os gráficos também foram produzidos usando o programa GraphPad Prism 5.0.

3. Resultados

3.1. Efeito do pH em L. fermentum TCUESC01 crescimento e Viabilidade

l. fermentum TCUESC01 foi capaz de crescer em meio a pH 5, pH 6 e pH 7 (Figura 1). No entanto, o crescimento não foi observado fora dessa faixa de pH (Figura 1).

(a)

b)

(c)

d)

(em)

(f)

(en)

(h)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figura 1

Crescimento de Lactobacillus fermentum TCUESC01 no período de 0 a 10 horas de culturas a 37°C em diferentes pH: (a) crescimento na MRS, sem modificação de pH (pH 6.52); (b) o crescimento na MRS com pH 2; (c) crescimento na MRS com pH 3; (d) o crescimento na MRS com pH 4; (e) o crescimento na MRS com pH 5; (f) o crescimento na MRS com pH 6,; g) crescimento da MRS com pH 7; h) crescimento da MRS com pH 8; i) crescimento da MRS com pH 9. Cada ponto do gráfico representa a média e o desvio padrão de três experimentos.

3.2. Tolerância de L. fermentum TCUESC01 Gastrointestinal Condições In Vitro

A tolerância de L. fermentum TCUESC01 gastrointestinal passagem foi avaliada sob condições concebido para imitar o trato gastrointestinal humano (Figura 2). Uma solução bacteriana foi cultivada até uma concentração de 8,7 × 108 UFC·mL−1 em uma solução de leite a 10%. Após submeter a bactéria a uma solução contendo pepsina a pH 2,5 por 1,5 h para simular o suco gástrico, observou−se uma redução estatisticamente significativa () da concentração bacteriana para 1,23 × 108 UFC·mL-1. Depois de lavadas com solução salina, as bactérias foram então submetidas a uma solução de bile suína a 1% a pH 8,0 por 45 minutos para simular o ambiente intestinal. Após este tratamento, observamos uma redução de cerca de 1 log na contagem bacteriana (3,6 × 107 UFC·mL−1). A redução das contagens bacterianas durante a incubação no suco intestinal simulado não foi estatisticamente insignificante.

Figura 2

Sobrevivência de Lactobacillus fermentum TCUESC01 durante a passagem através do simulado do trato gastrointestinal. “Leite fermentado” após fermentação do leite; “suco estomacal simulado” após passagem em solução salina pH 2,5 + pepsina;” suco intestinal simulado ” após passagem na bile de boi 1%. Cada ponto no gráfico representa a média e o desvio padrão de três experimentos. Redução estatisticamente significativa () em relação ao ” leite fermentado.”

3.3. Sobrevivência de L. fermentum TCUESC01 sob condições comerciais de armazenamento

para avaliar sua sobrevivência durante o armazenamento, as bactérias l. fermentum foram refrigeradas a 4°C por 28 dias em um leite não gordo 10% estéril acidificado a pH 4,5 com ácido láctico (Figura 3). A cepa bacteriana estava inicialmente em uma concentração de 3,6 × 109 UFC * mL-1, mas após 7 dias de armazenamento observamos uma redução estatisticamente significativa de aproximadamente 1 log na contagem bacteriana. Do dia 7 ao dia 21, houve um crescimento inesperado de 4,3 × 108 UFC·mL−1 a 9,0 × 108 UFC·mL−1. No dia 28, a concentração bacteriana diminuiu para 2,83 × 108 UFC·mL−1.

Figura 3

Sobrevivência de Lactobacillus fermentum TCUESC01 em leite fermentado de 0 a 28 dias, a 4°C. Cada ponto representa a média e o desvio padrão de três experimentos. “a”: diferença estatisticamente significativa em relação ao dia zero (); “b”: diferença estatisticamente significativa em relação ao dia 14; “c”: diferença estatisticamente significativa em relação ao dia 21.

3.4. Autoagregação de L. fermentum TCUESC01

as bactérias agregaram-se cada vez mais até a quinta hora de cultura in vitro, altura em que foi observado um máximo de 70,19 ± 1,78% de agregação (Figura 4). No entanto, os aumentos horários na agregação percentual foram estatisticamente significativos apenas até a terceira hora do experimento ().

Figura 4

Percentagem de autoaggregation de Lactobacillus fermentum TCUESC01 avaliados de 1 a 5 horas de cultivo em caldo MRS a 37°C. “a”: diferença estatisticamente significativa em relação à 1ª hora de agregação; “b”: diferença estatisticamente significativa em relação à 2ª hora de agregação . Cada ponto representa a média e o desvio padrão de 3 experimentos.

3.5. Susceptibilidade de L. fermentum TCUESC01 a antibióticos

esta estirpe de L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 foi suscetíveis à amoxicilina, amoxicilina e ácido clavulânico, penicilina G, β-lactams cefotaxima e cefalotin, os aminoglicosídeos, amicacina e gentamicina, a lincosamide clindamicina, a carbapenem imipenem, os macrolídeos a azitromicina e a eritromicina, a phenicol cloranfenicol e tetraciclina. A cepa também foi moderadamente suscetível à estreptomicina.

4. Discussão

diretrizes estabelecidas pela FAO e pela OMS afirmam a necessidade de analisar as propriedades funcionais e a segurança das bactérias antes de propor seu uso em uma matriz alimentar . Inicialmente, avaliamos a capacidade desta espécie de Lactobacillus de crescer e sobreviver em pH diferente e, embora exibisse crescimento apenas na faixa de pH 5 a pH 7, permaneceu viável durante incubações de 10 h em todos os níveis de pH avaliados, com exceção de pH 2. Estudos demonstraram ampla variabilidade no pH gástrico quando o estômago está vazio, com valores médios inferiores a pH 4 . O ambiente intestinal é mais estável e varia entre pH 6 e pH 8, dependendo da região intestinal avaliada . Portanto, embora essa bactéria láctica não tenha mostrado a capacidade de se multiplicar ou sobreviver abaixo de pH 2,5, ela permanece viável na faixa de pH intestinal e, portanto, pode funcionar nesse ambiente. Consistente com os nossos dados, Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ, e ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) e Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) isolada a partir de uma consumido bebida fermentada (Boza) da Península dos Balcãs, mostrou boas taxas de crescimento, durante 10 h de incubação entre pH 5 e pH 7 . L plantarum 423 isolado da bebida do sorgo, L. plantarum 241 isolado do íleo do porco, l. curvatus DF38 isolado do salame, e Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 isolado de secreções vaginais humanas também mostrou crescimento entre pH 5 e pH 6,5 em experimentos semelhantes . No geral, nossos resultados demonstram que l. fermentum TCUESC01 tem crescimento e resistência ao pH semelhantes a outras bactérias probióticas extraintestinais potenciais. Além disso, a sensibilidade da cepa aos níveis de pH inferiores a 2,5 pode ser superada pelo uso de métodos que protegem as bactérias, como a microencapsulação . Nossos resultados apoiam a aplicação potencial desta cepa como aditivo probiótico em alimentos com características distintamente ácidas, por exemplo, queijos, sucos e leite fermentado.

o ambiente gastrointestinal pode ser hostil para muitas bactérias; uma variedade de estressores, como acidez, enzimas digestivas e sais biliares, podem influenciar negativamente sua sobrevivência durante o trânsito para o intestino . O Lactobacillus neste estudo mostrou uma redução quantitativa discreta, mas permaneceu viável sob condições gástricas e intestinais e resistiu a uma concentração de bile três vezes que encontrada no intestino humano (0,3%) . Semelhante aos nossos dados, Kaushik et al. observou-se que o Lactobacillus plantarum Lp9 diminuiu cerca de 0,5 log a partir de sua concentração inicial quando exposto a condições que imitam o estômago (pH 2) e 1 log quando exposto a condições que imitam o intestino. Em outro estudo, L. rhamnosus VT1 / 1 Isolado de queijo mostrou uma redução de aproximadamente 2 log em concentração em condições de pH baixo (pH 3) e uma redução de 1 log em concentração quando incubado em pH 7 na presença de 2% de sais biliares . Nossos resultados sugerem que L. fermentum podia se mover através do sistema gastrointestinal e sobreviver em concentrações acima de 107 UFC g−1 (ou UFC·mL−1), que estudos anteriores sugerem seria suficiente para interagir e/ou interferir com o ambiente de host .

a matriz alimentar também é um fator de influência na viabilidade dos microrganismos durante seu armazenamento . Ao testar a sobrevivência a longo prazo de L. fermentum TCUESC01 no leite acidificado, observamos uma redução inicial das contagens bacterianas seguida por um ligeiro aumento do dia 7 ao dia 21. Este crescimento pode ser explicado pela continuação do metabolismo bacteriano na solução láctica, embora a uma taxa reduzida devido à baixa temperatura. Donkor et al. também observou variação quantitativa em bactérias probióticas durante o armazenamento a 4°C, especialmente Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 que exibiu crescimento de 1 log do dia 7 ao dia 14 de armazenamento a frio. Em outro estudo, L. plantarum armazenado em leite fermentado reduziu significativamente sua concentração celular em 1 log durante aproximadamente 28 dias de armazenamento a 4°C. Embora l. fermentum tenha apresentado uma diminuição de 1 log em relação à sua concentração inicial no último dia de Armazenamento, sua concentração estava acima da média na data de validade da solução láctica . Da mesma forma, com base nas recomendações da Agência Nacional de monitoramento sanitário (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 pode ser introduzido em matrizes alimentares semelhantes ao leite fermentado e sobreviver em concentrações adequadas até a data de validade do produto .

microrganismos com capacidade de autoagregação permanecem nos intestinos por mais tempo e, portanto, têm melhores interações com as células epiteliais e o sistema imunológico do hospedeiro . A cepa L. fermentum TCUESC01 demonstrou uma capacidade elevada de autoagregação em nosso ensaio de 5 h. Este resultado é maior do que o relatado por Beganović et al. , que demonstrou que l. fermentum A8 tinha 60,9 ± 3.Autoagregação de 91% após 5 h de incubação, ou aquela relatada por Bao et al. , que demonstrou autoagregação de menos de 28% para 10 cepas de L. fermentum após uma incubação de 20 h. Com base em nossos resultados, l. fermentum agrega bem e, se ingerido, provavelmente seria capaz de persistir no ambiente intestinal humano por longos períodos de tempo.Finalmente, avaliamos a suscetibilidade do TCUESC01 a uma variedade de antibióticos. O conhecimento da suscetibilidade a antibióticos é extremamente importante quando consideramos três fatores importantes: a rara possibilidade de infecção por Lactobacillus, o risco de transferência horizontal de genes de resistência para micróbios nativos e a associação entre bactérias probióticas e tratamento com antibióticos. L. fermentum TCUESC01 expostos a susceptibilidade à maioria dos antibióticos, com exceção do ácido nucleico inibidores da síntese (norfloxacina, ciprofloxacina, sulfonamida, e cotrimoxazol) e dois inibidores da síntese da parede celular (vancomicina e cefoxin). Esses resultados corroboram dados publicados por Kirtzalidou et al. em 74 cepas de Lactobacillus ssp. isolado de fezes humanas, das quais 94.5% das cepas eram resistentes à amicacina, todas eram resistentes à canamicina e à ciprofloxacina, 84,7% das cepas eram resistentes à vancomicina, 1,6% eram resistentes à cefalotina e 8,5% das cepas eram resistentes à bacitracina. Em geral, os lactobacilos apresentam resistência intrínseca às quinolonas, trimetoprim, sulfonamidas, vancomicina e a maioria dos inibidores do ácido nucleico, ao mesmo tempo que mostram suscetibilidade aos inibidores da síntese protéica, com exceção dos aminoglicosídeos . Vale ressaltar que a resistência aos antibióticos aqui observados é intrínseca ao gênero, como evidenciado em estudos publicados, e a transferência horizontal de genes é, portanto, incomum. Em resumo, o perfil de resistência de L. fermentum TCUESC01 suporta a possibilidade de uso em conjunto com antibióticos que atuam inibindo a síntese de ácido nucleico.

5. Conclusões

apesar de ser uma cepa extraintestinal isolada durante a fermentação do cacau, l. fermentum TCUESC01 mostra forte potencial como probiótico para aplicação em produtos alimentícios. Permanece viável em um amplo espectro de pH e, portanto, é adequado para inclusão em diferentes tipos de alimentos. Quando armazenado em um produto lácteo refrigerado, mantém a viabilidade acima dos níveis recomendados por organizações nacionais e internacionais reconhecidas até a data de validade do produto. Sob condições que imitam o trânsito gastrointestinal, ele também sobrevive em quantidades suficientes para a manutenção do potencial probiótico. Em termos de seus comportamentos previstos dentro dos intestinos, l. fermentum TCUESC01 mostra uma forte tendência a autoagregar. Finalmente, esta cepa exibe suscetibilidade a antibióticos e perfis de resistência que permitirão seu uso ao lado de terapias medicamentosas. Em conjunto, essas características sugerem que l. fermentum TCUESC01 tem grande potencial como um aditivo alimentar probiótico seguro.

conflitos de interesse

os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

agradecimentos

esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB). The Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES) provided productivity and graduate fellowships for some authors.