2.3.4.1 A Estrutura
O apo-sCTLA-4 homodimer foi expressa como uma trombina-cleavable Fc proteína de fusão em células CHO, na presença de kifunensine.23 Após a deglicosilação, o homodímero produziu cristais difratando para espaçamentos de Bragg de 1,8 Å, com dimensões de célula unitária de a = 43,86 Å, b = 51,46 Å e c = 102,85 Å, e o grupo espacial P212121 (Ref. 130). A estrutura foi resolvida por substituição molecular. A unidade assimétrica compreendeu um homodímero dissulfeto-ligado permitindo comparações com os complexos sctla-4/sB7-1 e sctla-4 / sB7-2, e com sctla-4 ligado a uma lipocalina projetada.131
os dois monômeros na unidade assimétrica foram compostos por domínios β-sanduíche com topologia AGFCC’ e ABED, conforme previsto por Metzler et al.132 um dissulfeto de “talo” curto de oito resíduos ligado a Cys122 ligava os domínios IgSF à membrana. Inesperadamente, as duas metades do homodímero apo-CTLA-4 eram menos semelhantes entre si do que às suas contrapartes complexas, enfatizando que a ligação não é acompanhada por rearranjos estruturais em grande escala (Fig. 2, 2 H). As comparações de estruturas automatizadas identificaram CD28 e PD-1 como as estruturas mais semelhantes ao CTLA-4. Diferenças importantes entre CTLA – 4 e CD28 foram: (i) a presença de uma torção em β-strand G de CD28, (ii) mudanças no ciclo de tamanho, incluindo estendido AB, BC e CC’ loops em CTLA-4 e uma truncado C”D loop, e (iii) H-ligação C’ e C” β-fios resultante do reposicionamento do C ‘C” loop em CD28. De importância fundamental foi a conformação amplamente idêntica da sequência FG loop 99myppy104 formando o núcleo de suas superfícies de ligação ao ligante. Apenas uma única molécula de água poderia ser encontrada na superfície de ligação ao ligante excepcionalmente seca de apo-CTLA-4, enquanto 228 águas foram detectadas em outro lugar.
após CD28 e PD-1, as próximas estruturas mais semelhantes ao Domínio CTLA-4 V-set foram 215 anticorpo ou TCR V-domínios, diferindo principalmente em comprimentos de loop apenas. O r.m.s. diferença de superposição de CTLA-4 com o mais semelhante TCR Va domínio foi 2.09 Å para 102 resíduos, contrastando com 2.89 Å para 86 resíduos para a superposição com d1 do CD2. As características compartilhadas importantes com o domínio Va incluíram o laço longo do CC ‘e β-protuberâncias conservadas nos β-fios de C’ e de G que impõem uma torção pronunciada na β-folha do AGFCC’. Especialmente digno de nota foi o alto grau de conservação de sequência e conformação de Ca perto da cadeia g β-bulge, isto é, GNGTQIYV (CTLA-4) e GDGTQLVV (Va). Em CD2 e CTLA-4, os loops foram semelhantes, e os domínios diferiram na medida em que: (i) no CD2 não houve H-ligação ßA e ßB vertentes, (ii) não houve torção de UM’GFCC’ β-folha de CD2 devido ao reposicionamento da β-papos, (iii) o posicionamento do C” β-strand em CD2 mas não CTLA-4 autorizados canônico H-ligação e a extensão da AGFCC’C” β-folha, e (iv) CTLA-4 faltou a torção no FG loop presente no CD2 (e também, por exemplo, B7-1). A análise de cinquenta e dois domínios IgSF de V-set usando um programa de alinhamento de estrutura sequente133 indicou que a família CD28/CTLA-4 compreende um subgrupo de domínios V-set distintos dos agrupamentos de CD8, receptores de antígeno e moléculas de “adesão”, por exemplo, B7-1 e CD2. No geral, houve maior semelhança do subgrupo CD28/CTLA-4 com a família de receptores de antígeno, em comparação com o conjunto de adesão. A análise sugeriu que as proteínas da família CD28 / CTLA-4 e os receptores de antígeno compartilhavam um ancestral comum possivelmente semelhante ao PD-1, com as duas famílias divergindo precocemente.
Apo-CTLA-4 compreendeu um homodímero com suas subunidades adotando um arranjo favorecendo interações bivalentes ortogonais com ligantes posicionados em superfícies celulares aposantes. Comparações com os pares de monômeros CTLA-4 nos complexos B7-1 E B7-2106,107 e o monômero no complexo de lipocalin131 revelaram flexibilidade rotacional muito limitada na interface homodímero e notavelmente poucas, se houver, alterações atribuíveis à ligação do ligante. As únicas diferenças foram aparentes no complexo B7-2, com ligeiro reposicionamento dos loops BC e CC’, e do fio c” β e loops vizinhos, e diferenças conformacionais no fio G β em seu terminal C. Essas variações locais estavam distantes do local de ligação do ligante do CTLA-4 e, em nenhum caso, os monômeros apo diferiram sistematicamente dos cinco monômeros CTLA-4 complexados. As posições do átomo da cadeia principal da sequência 99MYPPY104 eram essencialmente idênticas.
as estruturas dos complexos formados por CTLA – 4 com B7-1 E B7-2, que não haviam sido comparados anteriormente, eram bem diferentes.130 substituição Em B7-2, de Val28 vs Arg29 Em B7-1, formou uma bolsa de Ligação Em B7-2 que só foi preenchida em parte por CTLA-4. Isso garantiu que o complexo B7-1/CTLA-4 exibisse melhor complementaridade de forma do que o complexo B7-2 / CTLA-4. Compensando um pouco por isso, a área de superfície enterrada em B7-2 por CTLA-4 era um pouco maior do que a de B7-1. No geral, o CTLA-4 ligado ao B7-1 de uma maneira ainda mais rígida do que o CTLA-4 engatou o B7-1. A ligação B7 – 2 por CTLA-4 foi, no entanto, mais complexa e tinha a marca registrada de “ajuste induzido.”Em CTLA – 4 bound-vs apo-B7-2, houve uma mudança de 2,3-3,5 Å do loop FG B7-2 em direção a CTLA-4, que foi iniciada por uma rotação de ~ 120 graus de Phe31 de B7-2 (Ref. 130). Isso produziu uma interação de empilhamento de Phe31 com Pro102 da sequência 99MYPPY104 de CTLA-4.
