Kluyveromyces marxianus desenvolvimento de etanol de tolerância durante a evolução adaptativa, com melhorias significativas de vários caminhos

Melhor resistência ao etanol depois de 100 dias de evolução

O tipo selvagem haplóides K. marxianus tensão foi cultivadas em meio com 6% (v/v) de etanol a 30 °C durante 100 dias, cerca de 450 gerações (ver Métodos para obter detalhes). Houve um aumento contínuo da biomassa (medido por OD600 diariamente) durante este período (Fig. 1A), indicando que a sobrevivência celular sob estresse de etanol pode ser melhorada. No final, obtivemos uma população de K. marxianus com resistência muito melhorada ao etanol (Fig. 1b). Ao longo, KM refere-se à cepa bruta antes da evolução, e KM-100D refere-se à população K. marxianus após a evolução de 100 dias. A resiliência máxima do etanol para KM foi de 7% (v / v)e para KM-100d, foi de até 10% (Fig. 1b). Comparamos perfis de crescimento entre KM E KM-100D em meios de cultura com diferentes níveis de etanol(0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% V / V, Fig. 1c). Na ausência de etanol, não houve diferença significativa entre as cepas. Sua diferença aumentou com o aumento do nível de etanol e atingiu o máximo com 6% (V/v) de etanol em meios de cultura. Em tal circunstância, após 48 h, a biomassa de KM-100D era quase duas vezes maior que a de KM. Ambas as cepas apresentaram crescimento retardado em meio com 7% de etanol e não conseguiram crescer no meio com 8% de etanol. Além disso, O KM-100D também apresentou notável maior taxa de crescimento máximo do que o KM a 6% de etanol (arquivo adicional 1: Figura S1).

K. marxianus evolução em 6% (v/v) de etanol. um valor diário OD600 da população K. marxianus durante a evolução. As células foram transferidas todos os dias e subculturadas em um meio fresco contendo 6% (V/v) de etanol, com o mesmo OD600 inicial de 0,6. Em seguida, após incubação a 30 °C em um agitador orbital por 24 h, OD600 foi medido para registrar o crescimento celular. B Análise de diluição manchada para tolerância ao etanol entre pré e pós-evolução. As células KM e KM-100D foram inoculadas em meio líquido com etanol em uma das concentrações de gradiente: 0, 1, 2,…, 11% (V / v), respectivamente, e incubado a 30 ° C por 3 dias. Uma suspensão celular de 10 OD600 do meio líquido foi 5 vezes diluída em série e manchada em uma placa YPD e cultivada a 30 °C por 2 dias. perfis de crescimento C De KM e KM-100D em diferentes concentrações de etanol. A curva vermelha é para KM-100d, e a Preta é para KM. Durante o crescimento, perfil de medição, KM e KM-100d foram realizadas no biológica triplicado

a análise de DNA sugerem que a K. marxianus não tem nenhuma alteração de ploidia ou crítica genes durante a evolução adaptativa

Para elucidar DNA alterações no KM-100d, realizamos ploidia de DNA e análise de DNA mutação de identificação. Durante a evolução adaptativa, o conteúdo de DNA da população de K. marxianus tem pouca mudança (arquivo adicional 1: Figura S2); assim, nenhuma mudança de ploidia ocorreu. Por análise de DNA-seq de KM E KM-100D, que foram ambos mapeados para o genoma de referência de K. marxianus DMKU 3-1042, os locais SNP entre KM e KM-100D foram obtidos (arquivo adicional 2). Entre os 57 SNPs identificados, apenas 4 locais eram dominantes na população KM-100d. Três deles estão localizados na região codificadora dos genes SAN1, YAP1 e KHT2; o outro está no 445 bp a montante de ERG26. O local de 1324 de SAN1 foi mutado de C Para T e, consequentemente, o aminoácido correspondente foi transformado de arginina em cisteína. No entanto, de acordo com a análise do Pfam 32.0, esta mutação não se enquadra em nenhum domínio de proteína identificado. Ambas as mutações em YAP1 e KHT2 são mutações sinônimas sem mudança de proteína. As descobertas acima sugerem que as mudanças no contexto do DNA estão longe de ser suficientes para apoiar essa melhoria do fenótipo no KM-100D, e a reprogramação transcricional deve contribuir para isso. Portanto, Realizamos ainda a análise RNA-seq.

uma religação global induzida pela evolução de 100 dias

para entender completamente a tolerância ao etanol, realizamos uma análise RNA-seq para comparar expressões genéticas das leveduras KM e KM-100D que cresceram em mídia com etanol a 4% e 6% (v/v). Com base nos perfis de crescimento (Fig. 1C), observou-se que a capacidade de crescimento entre KM-100D E KM teve a diferença máxima em 48 h; portanto, amostras em 48 h foram coletadas para análise RNA-seq. Configuração / log2ratio / ≥ 1 e valor p < 0.05 como critério para definição de genes significativos expressos diferencialmente (DE), realizamos a identificação de genes em sete grupos (Fig. 2, denotado como 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7, respectivamente). Em cada grupo, a análise DE foi realizada de acordo com a seta apontando para o controle. O arquivo adicional 3 fornece valores de expressão e estatísticas de expressão diferencial de todos os genes. Há uma diferença de expressão global entre KM e KM-100D quando ambos cresceram em um meio livre de etanol (Fig. 2 grupo①). As leveduras KM – 100D têm 1342 genes com expressão mais alta do que a da levedura KM, enquanto apenas 188 genes têm expressão mais baixa. Em meios com etanol de 4% e 6% (v/v), o número de genes regulados em KM-100D é bastante reduzido para 415 (grupo②) e 453 (grupo③), respectivamente. No entanto, os números de genes regulamentados ainda são muito mais do que aqueles com expressão mais baixa (104 e 182 genes, respectivamente). Esses resultados sugerem que as leveduras KM-100D são reescritas transcricionalmente ativando um grande número de genes. A sugestão foi ainda apoiada pelas mudanças de expressão induzidas pelo etanol dentro das leveduras KM e KM-100D. Sob indução de 4% e 6% (v/v) etanol, as leveduras KM têm 1452 e 1465 genes regulados para cima (grupos ⑥ e⑦), enquanto as leveduras KM-100D têm apenas 631 e 596 genes regulados para cima (grupos ④ e⑤), respectivamente. Além disso, aplicamos mapa de calor.2 software no Pacote R para agrupar genes e grupos com base nos valores log2ratio (arquivo adicional 1: Figura S3) e encontrou o perfil de expressão diferencial gênico no grupo ① está próximo ao do Grupo⑦. Juntas, as leveduras KM-100D mantiveram muitas características de expressão induzidas pelo etanol, mesmo que crescessem em um meio livre de etanol. As características tornam a célula evoluída mais adaptativa à estimulação do etanol, ou seja, a levedura KM-100D não precisa ativar tantos genes quanto a KM.

análise Global de dados RNA-seq em KM e KM-100D sob estresse de etanol. Nesta figura, compartimentamos dados de RNA-seq para análise de expressão diferencial gênica. KM e KM-100D foram apresentados nas partes esquerda e direita, respectivamente, e as concentrações de etanol 0%, 4% e 6% (v/v) foram localizadas em fileiras. Os dados RNA-seq foram divididos em sete grupos, denotados como①,②,③,④,⑤, ⑥ e⑦. Em cada grupo, uma seta aponta para o controle de expressão diferencial de identificação, e o vermelho dígitos indicam o up-regulated gene número, enquanto os verdes representam o down-regulated número

Posteriormente, em cada grupo, foi realizada gene ontology (GO) enriquecimento análise DE genes (arquivo Adicionais 1: Figura S4), e descobriu que os Termos Go enriquecidos cobriam uma ampla gama de processos fisiológicos básicos celulares, incluindo biogênese do ribossomo, biossíntese de aminoácidos, reparo de DNA, processamento de RNA, etc., mas não diretamente relevante para a resistência ao etanol. Portanto, a seguir, nos concentramos particularmente em vias fortemente associadas ao metabolismo e tolerância do etanol, analisando os genes de associados (arquivo adicional 4).

KM-100d reforçada a utilização de etanol

Para facilitar o gráfico ilustração, o log2ratio valores envolvidos DE genes (arquivo Adicionais 4) foram subdivididos em cinco intervalos de: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (e acima), como mostrado na Fig. 3.

possíveis rotas de consumo de etanol em K. marxianus. Nesta figura, o etanol é consumido tanto no citoplasma (a parte superior) quanto nas mitocôndrias (a parte inferior). O retângulo azul-cinza denota o gene envolvido e os grupos①,②,③,④,⑤, ⑥ e ⑦ estão de acordo com essas definições na Fig. 2. Vermelho e verde no número do grupo denotam a regulação para cima e para baixo do gene, respectivamente. A intensidade da cor representa o grau de mudança de expressão gênica, a correspondência de cor e valor log2ratio é quantificada pela barra de cores no canto superior esquerdo da figura

a diferença entre KM e KM-100D no consumo de etanol foi investigada. Como ilustrado na Fig. 3, duas rotas podem existir para consumir diretamente etanol e foram reguladas em KM e KM-100d quando enfrentadas etanol (grupos④,⑤, ⑥ e⑦). Uma maneira é via ADH6 citoplasmático, que catalisa etanol em acetaldeído, facilitado por NADP+. O outro é pelo atf1 mitocondrial, que promove a esterificação do etanol com o auxílio do acetil-CoA. Especialmente, em KM-100D sob estresse de etanol (grupos ④ e⑤), YGL039W foi regulado para gerar mais NADP+ e, portanto, pode fornecer mais coenzimas para converter etanol em acetaldeído para reduzir a toxicidade do etanol. Nas mitocôndrias, para KM expostos ao estresse do etanol (grupos ⑥ e⑦), apenas C2E1P301 e ADH4 foram regulados para cima. Enquanto em KM-100d, durante o processo de etanol para aldeído para acetato, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 e ALD6 foram todos regulados (grupo①). As mudanças acima mencionadas indicam que o KM-100D pode adquirir nova capacidade para aliviar a toxicidade do etanol, aumentando o consumo de etanol. A teoria explica que o KM-100D realizou mais de KM em meio com etanol.Além de ser consumido, o etanol acumulado influencia diretamente a integridade da membrana celular, altera a pressão osmótica interna e externa , perturba a conformação de proteínas e induz a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), causando sérios danos à célula de levedura . A seguir, analisamos os genes de nessas vias para danos causados pelo Anti-etanol em K. marxianus (Fig. 4).

um diagrama esquemático para o anti-etanol causou danos em K. marxianus. Na parte esquerda desta figura, o etanol acumulado no meio impõe uma pressão osmótica à célula de levedura e, posteriormente, ativa a via responsiva osmótica. Na parte do meio, o etanol ambiental permeia a célula e interrompe a membrana celular. Na parte direita, os lipídios da membrana celular são sintetizados para fortalecer e reparar a membrana celular danificada. Na parte inferior, o etanol perturba a conformação das proteínas e causa estresse oxidativo, assim os sensores relacionados e as vias de resposta são ativados. Os números e cores do grupo para a expressão diferencial do gene estão alinhados com os da Fig. 3

após a evolução impulsionada pelo etanol, a via de resposta ao estresse do álcool em KM-100D foi ativada. ASR1, que translocates do citoplasma para o núcleo com a exposição ao etanol , e ETP1, que atua como um citoplasmática de retenção de proteína com um papel em etanol dependente da activação da transcrição heat shock protein genes , foram ambos regulamentados no KM-100d (Grupo①), e em parte até regulado no KM enfrentou etanol (Grupos ⑥ e⑦), sugerindo que mesmo em uma mistura etanol-livre médio, KM-100d pode preparar ágil caminhos para o etanol desafio, assim como KM da resposta ao etanol.

a formação de lipídios de membrana desempenha um papel importante na manutenção da integridade da membrana celular sob estresse do etanol . Os ácidos graxos insaturados, os principais componentes da estrutura da membrana celular, estão intimamente relacionados à tolerância ao etanol . Ilustrado na Fig. 4, a partir de acetil-CoA para a biossíntese de ácidos graxos insaturados para incorporação em fosfolipídios, os genes implicados PPT2, FAD2, e TAZ1 foram todos até regulado no KM-100d (Grupo①), sugerindo que, após a evolução, KM-100d já pode melhorar a biossíntese de ácidos graxos insaturados para o fornecimento de matéria-prima para a membrana celular biogênese. E a regulação negativa dos genes ACC1, TSC13, FAS1 em KM expostos em etanol( grupos ⑥ e⑦), está de acordo com o relatório anterior, que pode explicar a fraca tolerância ao etanol de K. marxianus antes da evolução adaptativa.

um grande número de genes associados à biogênese lipídica da membrana celular, incluindo fosfoglicerídeo, esfingolipídeo e esterol, foram expressos diferencialmente sob estresse do etanol (Fig. 4). Especialmente, os genes envolvidos na biossíntese de fosfoglicerídeos foram geralmente regulados em KM-100D (grupo①) e em etanol de face KM (grupos ⑥ e⑦), indicando que o fosfoglicerídeo pode ser o principal componente na membrana celular para resistência ao etanol. Para a biossíntese de esterol, muitos genes (por exemplo, ERG9 e ERG7) foram regulamentados em Grupos ④ e⑥, e vários genes foram regulamentadas no Grupo ⑤ (por exemplo, ERG25) e o Grupo ⑦ (por exemplo, ERG26), sugerindo que esterol biogênese pode ser importante para o pé até o alto do etanol, mas não para baixo etanol. Além disso, os genes CKI1, ERG2 e ERG25, envolvidos na biossíntese de fosfoglicerídeos e esteróis, foram regulados apenas no Grupo⑤; esta pode ser uma das pistas para o melhor desempenho de KM-100D do que KM em etanol alto.

alta concentração de etanol em um meio impõe estresse osmótico nas células de levedura . Como mostrado na Fig. 4, o plasma membrana osmótica sensores (SLN1, OPY2, e SHO1) e genes (HOG1, SSK1, e SSK2) envolvidos na jusante responsivo via eram tudo regulado em KM exposta na baixa de etanol (Grupo⑥), e individualmente up-regulated no KM-100d (Grupo①), no KM-100d enfrentou etanol (Grupos ④ e⑤), e no KM confrontado alta do etanol (Grupo⑦). A produção de glicerol é uma maneira importante para S. cerevisiae resistir à pressão osmótica . Quando KM e KM-100D enfrentaram o etanol, a maioria dos genes relacionados à biogênese do glicerol foram regulados para baixo. As descobertas acima sugerem que antes e depois da evolução, K. marxianus sempre melhorar caminhos para detectar e transduzir sinais de estresse osmótico; no entanto, sua estratégia para resistir ao estresse osmótico pode não depender da rota de produção de glicerol, deve haver algumas outras maneiras.

A Parede Celular fornece resistência mecânica suficiente para a célula suportar a pressão osmótica , e a via secretora não apenas transporta as proteínas da parede celular para fora, mas também transfere lipídios para a membrana plasmática para fortalecer a estrutura da membrana; portanto, esses dois processos podem ser responsáveis pelo estresse anti-osmótico. Analisamos os genes DE na Via secretora e na biogênese Da Parede Celular (arquivo adicional 1: Figura S5). Os Genes envolvidos na Via secretora e na biogênese da parede celular foram geralmente regulados em KM-100D (grupo①), e alguns deles também foram regulados em KM expostos em etanol (grupos ⑥ e⑦). Isso implica que o KM-100D não apenas manteve a regulação positiva na Via secretora para KM resistente ao estresse do etanol, mas também ampliou amplamente o escopo de ativação da via secretora para se preparar para o ataque do etanol; assim, o aprimoramento da via secretora e da formação da parede celular pode ser a nova estratégia KM-100D desenvolvida para suportar o estresse osmótico causado pelo etanol. Por outro lado, para KM e KM-100D expostos em baixo etanol (grupos ④ e⑥), muitos genes na Via secretora foram ambos regulados para baixo, sugerindo que a ativação da via secretora pode não ser a maneira necessária para K. marxianus responder a baixo etanol.

contra o estresse oxidativo desencadeado pelo etanol (Fig. 4), HYR1, que funciona como um sensor e um transdutor do esforço do hydroperoxide , foi up-regulado no KM e no KM-100D ambos expostos no álcool etílico alto (grupos ⑤and⑦). Os fatores de transcrição responsivos ao estresse oxidativo SKN7 e STB5 foram regulados em KM-100D (grupo①) e em KM enfrentaram alto etanol (Grupo⑦). Para o estresse anti-oxidativo, os genes envolvidos no sistema de superóxido dismutase (por exemplo, MTM1 e PRX1) foram geralmente regulados em KM-100d expostos em etanol ou não (Grupos①, ④ e⑤). Para o sistema tioredoxina, genes (por exemplo. Mxr1 e TRR1) foram regulados em KM e KM-100D ambos enfrentaram etanol. A tioredoxina e sua redutase também foram relatadas para aumentar a tolerância de K. marxianus a vários inibidores derivados de lignoceluloses . Para o sistema glutaredoxina, os genes GRX2 e GLR1 foram regulados apenas em KM-100D expostos em etanol alto (Grupo⑤). Para o biogênese, genes, tais como PEX6 e PEX7 foram regulamentadas no KM-100d (Grupo①), e alguns outros genes (por exemplo, PEX3 e INP2) foram regulamentados em KM e KM-100d quando confrontados baixa etanol (Grupos ④ e⑥). O acima implica que KM-100D pode fortalecer globalmente a capacidade anti-oxidação.

para assegurar o dobramento apropriado da proteína sob o esforço do álcool etílico (Fig. 4), o choque térmico fator de transcrição HSF1 foi regulamentada em KM e KM-100d enfrentou baixa etanol (Grupos ④ e⑥), um número de acompanhante-genes relacionados (e.g. PFD1 e CPR7) foram regulamentadas no KM enfrentou etanol (Grupos ⑥ e⑦), também manteve-regulação no KM-100d (Grupo①). Alguns genes (por exemplo, CPR4) regulados em km enfrentados etanol não foram regulados em KM-100D. Portanto, O KM-100D pode geralmente melhorar o dobramento de proteínas para fornecer um ambiente celular mais estável.

foi relatado que em S. cerevisiae, o acúmulo de trealose foi importante para a tolerância ao etanol, devido à trealose funcionar como soluto compatível para evitar o influxo de sais em excesso nas células de levedura; enquanto isso, genes envolvidos na degradação da trealose também foram induzidos pelo etanol, para ajustá-lo na concentração ideal . Para K. marxianus (Fig. 4), descobrimos que os genes que participam da biossíntese e degradação da trealose (por exemplo., NTH1 e TSL1) foram comumente regulados para cima quando tratados com baixo etanol (grupos ④ e⑥), mas não o gene regulado para cima no metabolismo da trealose quando exposto em etanol alto (grupos ⑤ e⑦). Isso sugere que, em K. marxianus, a acumulação de trealose pode ser uma estratégia especial para lidar com o baixo teor de etanol, mas não para o alto teor de etanol.

as expressões diferenciais de 15 genes envolvidos nas vias tolerantes ao etanol acima foram validadas com análise RT-qPCR (Fig. 5). Expressões dos Genes no grupo ① (Fig. 5a) foram geralmente regulamentados. Por outro lado, a regulação positiva dos genes no grupo ④ (Fig. 5d) e Grupo ⑤ (Fig. 5e) não era tão alto quanto no grupo ⑥ (Fig. 5B) e Grupo ⑦ (Fig. 5c). Nossa análise confirmou que os genes que contribuem para a tolerância ao etanol são continuamente ativados em KM-100d mesmo após a retirada do estresse do etanol. A expressão gênica contínua pode ser útil para estabilizar o ambiente intracelular e se beneficiar do crescimento de células no próximo estresse.

análise RT-qPCR para expressão diferencial gênica de KM e KM-100D em diferentes grupos. um KM-100D vs. KM ambos no meio livre de etanol. Isto é para a análise do gene de no grupo①. B KM exposto em etanol a 4% (v/v) vs. KM em meio sem etanol. Isso é para o Grupo⑥. C KM exposto em etanol a 6% (v/v) vs. KM em meio sem etanol. Isso é para o Grupo⑦. D KM-100D exposto em 4% (v/v) etanol vs. KM-100D em um meio livre de etanol. Isto é para o grupo④. E KM-100D exposto em 6% (v/v) etanol vs. KM-100D em um meio livre de etanol. Isso é para o Grupo⑤. Em cada amostra, foram utilizados 18S como controle interno. O RNA Total foi isolado das pilhas cultivadas em 48 h no triplicate biológico

validação do consumo aprimorado de etanol e resistência ao estresse múltiplo em KM-100D

verificamos o crescimento de leveduras KM e KM-100D em meio YNB com diferentes fontes de carbono (Fig. 6a). As leveduras KM e KM-100D têm a mesma capacidade de utilizar a glicose como a única fonte de carbono. No entanto, na presença de 1% e 2% (V/v) de etanol como única fonte de carbono, as leveduras KM-100D cresceram melhor que as leveduras KM. O resultado apóia nossa hipótese acima mencionada de que as leveduras KM-100D utilizaram o etanol com mais eficiência do que as leveduras KM.

ensaio de crescimento celular sobre etanol e viabilidade celular e fermentação sob múltiplas tensões. um ensaio de crescimento celular de KM e KM-100D baseado em glicose ou etanol como fonte de carbono. Uma suspensão celular de 10 OD600 foi cinco vezes diluída em série e manchada em uma placa YNB com glicose ou etanol como a única fonte de carbono e cultivada por 2 dias, conforme ilustrado ao longo das colunas. ensaio de viabilidade de células b De KM e KM-100D sob estresse térmico. As temperaturas são 30 °C, 37 °C, 40 °C e 45 °C. ensaio de viabilidade celular sob estresse oxidativo. H2O2 foi usado como estímulo de oxidação, e suas concentrações são 0%, 0,04%, 0,06% e 0,08%. d viabilidade celular sob pressão osmótica. Sal elevado (NaCl) foi usado para causar pressão osmótica, com concentrações de 0 M, 0,5 M, 0,6 M e 0.7 m. e rendimento de etanol e utilização de glicose em KM E KM-100D na circunstância básica. f rendimento de etanol e utilização de glicose sob 45 °C. G rendimento de etanol e utilização de glicose sob 6% (v/v) estresse de etanol. h rendimento de etanol e utilização de glicose sob 8% (v / v) estresse de etanol. Na subfigura b-d, KM e KM-100D estão na primeira e segunda linhas, respectivamente. Uma suspensão celular de 10 OD600 foi 5 vezes diluída em série e manchada em uma placa YPD e cultivada por 2 dias. Exceto para o teste térmico com temperaturas especificadas, outros testes foram todos realizados a 30 °C. Na subfigura e-h, O eixo Y esquerdo e o eixo y direito representam resíduos de Glicose no meio (denotado em preto) e produção de etanol (denotado em azul), respectivamente

por outro lado, com base na Fig. 4, KM-100D podem desenvolver a resistência aos esforços múltiplos etanol-causados simultaneamente, incluindo o esforço osmótico, o esforço oxidativo, e o esforço térmico (para proteínas de choque do calor tomadas como acompanhantes para a dobradura da proteína). Para avaliar as tolerâncias das leveduras a tensões múltiplas, realizamos o ensaio de viabilidade celular para várias pressões de temperatura, oxidação e osmótica, respectivamente (Fig. 6b-d). Na circunstância básica (ou seja, 30 °C, 0% H2O2 e 0 m NaCl), falta uma diferença de viabilidade entre as leveduras KM e KM-100D. No entanto, na presença das diferentes tensões, as leveduras KM-100D apresentam viabilidade significativamente melhor do que as leveduras KM. Além disso, as vantagens são mais significativas enquanto as tensões se tornaram mais sérias (Fig. 6b-d). Esperávamos que as tolerâncias a múltiplas tensões pudessem introduzir novos recursos para as leveduras na produção de etanol.

investigamos ainda mais a produtividade do etanol entre as leveduras KM e KM-100D sob múltiplas tensões. Em circunstâncias básicas (30 °C e 0% de etanol, Fig. 6E), as leveduras KM e KM-100D são quase as mesmas no consumo de glicose e na produção de etanol. No entanto, as leveduras KM-100D apresentaram vantagens significativas na presença de alta temperatura (45 °C, Fig. 6F) ou mais etanol (6% ou 8%, Fig. 6g, h); o ambiente comum geralmente acontecia no estágio final da fermentação. Realizamos uma análise RT-qPCR para leveduras KM e KM-100D fermentadas em meio com etanol a 6% a 48 h, 72 h E 120 h (Fig. 7). A maioria desses genes tolerantes ao etanol foi regulada em KM-100d em comparação com EM KM, especialmente no estágio anterior (48 h) para ajuste inicial ao etanol (Fig. 7). Resumindo, por meio da regulação positiva de expressões de genes tolerantes ao etanol, as leveduras KM-100D superaram as leveduras KM em ambientes estressantes com aumento da produção de etanol.

análise RT-qPCR para expressões genéticas em KM e KM-100D durante a fermentação. a KM-100D vs. KM ambos a 48 h em fermentação. B KM-100D vs. KM ambos a 72 h em fermentação. C KM – 100D vs. KM ambos a 120 h em fermentação. Em cada amostra, foram utilizados 18S como controle interno. Tanto o KM quanto o KM-100D foram cultivados em meios com 6% de etanol. O RNA Total foi isolado das pilhas cultivadas no triplicate biológico