Discussão
observada a produção de altos níveis de atividade de protease durante contínuo cultura de K. sedentarius facilitou a purificação de duas proteases, P1 e P2, que eram ativas contra a azocaseína, a cadeia β de insulina, queratina extraída de calo humano e calo não processado. As características gerais dessas enzimas, incluindo faixa de substrato, temperatura e pH ideais e sensibilidade aos inibidores da protease, sugerem que eles são bioquimicamente semelhantes e provavelmente pertencem à família da protease de serina alcalina. Essas proteases são produzidas por uma ampla variedade de microrganismos e atuam como endopeptidases (Rao et al. 1998).
se as enzimas também podem ser classificadas como queratinases, no entanto, continua sendo uma questão de debate. As queratinases, por definição, devem ser capazes de hidrolisar a queratina nativa pura. A extração da queratina, no entanto, pode ser alcançada apenas por tratamento prévio com agentes desnaturantes para separá‐la das proteínas não queratina. Tratamentos mecânicos, como moagem de bolas, resultam na clivagem de ligações dissulfeto, que tornam a proteína mais suscetível à digestão proteolítica por proteases como tripsina e proteinase K, que não são classificadas como queratinases (Noval e Nickerson 1959). Da mesma forma, o uso de substratos esterilizados por calor em ensaios de queratinase também foi criticado porque o aquecimento pode causar desnaturação de queratina.
embora no presente estudo o calo finamente moído tenha sido usado como substrato enzimático, o fluido sobrenadante de cultura foi ativo contra pedaços de calo intacto. Portanto, mesmo que as duas proteases não sejam estritamente queratinases, elas degradam o calo humano in vitro e há algumas evidências de que isso também ocorre in vivo (Nordstrom et al. 1987).
as Proteases também foram classificadas como queratinases como resultado de sua atividade na redução da queratina, caso em que agentes redutores foram adicionados à mistura de ensaio enzimático ou usados durante a extração de queratina. Embora a atividade queratinolítica de uma variedade de bactérias cutâneas tenha sido estudada usando queratina ‘nativa’ como substrato, o agente redutor, ditiotreitol (DTT), foi incluído na mistura de ensaio. Por exemplo, quando a atividade aparente da queratinase de Staphylococcus epidermidis foi estudada na ausência de TDT, nenhuma atividade foi detectada (Mikx e de Jong 1987). Da mesma forma, uma serina protease de Candida albicans-queratinas degradadas que foram extraídas do estrato córneo de solas humanas com 8 mol L−1 ureia em Tris‐HCl e β‐mercaptoetanol (Hattori et al. 1984). No presente estudo, a queratina hidrolisada P1 e P2 que havia sido extraída do calo do pé humano com uréia e β‐mercaptoetanol, mas, importante, também foi capaz de degradar o calo não tratado.
o estrato córneo e o calo humano são uma estrutura complexa e estável da qual a queratina é um componente importante. Existem 30 genes humanos para queratina, dos quais 18 são expressos na pele (Fuchs 1995). Um resumo do banco de dados de queratina mostrou que toda queratina tem potenciais locais de clivagem para as proteases e Asp‐Arg e Gly‐Arg são os mais comuns. Se os filamentos de queratina forem inicialmente quebrados nesses locais, é possível que a degradação gradual dessas unidades menores ocorra em locais de clivagem secundária, produzindo uma faixa de tamanho de fragmentos de peptídeo, como mostrado pela análise do ataque de protease em queratinas extraídas de calos humanos. Os resultados apresentados na Fig. 3B indicam dois pH optima para a atividade calo-degradante de P2. Uma possível explicação é que existem duas enzimas na amostra. Isso parece improvável porque a amostra enzimática usada foi altamente purificada, como mostrado por PAGE com coloração de prata (ver Fig. 1, faixa 6). A possibilidade de duas enzimas degradadoras de calo na amostra P2 purificada com mobilidades muito semelhantes na página não pode ser descartada. No entanto, a mesma amostra foi testada usando os mesmos buffers com o ensaio de azocaseína e apenas um pH ótimo foi detectado em pH 10·2. Uma explicação alternativa é que o complexo substrato de calo/interação enzimática em diferentes pHs é um equilíbrio da atividade enzimática e mudanças conformacionais sutis do substrato, o que leva a pH duplo optima.
esta investigação mostrou que K. sedentarius produz duas proteases extracelulares que têm atividade degradante do calo. Informações básicas sobre seus tamanhos moleculares relativos, seus pIs, foram determinadas. No entanto, estudos cinéticos enzimáticos convencionais não puderam ser abordados porque o substrato natural usado nesses experimentos in vitro era uma mistura complexa de polímeros, insolúvel em água. O aumento da atividade enzimática de P2 na presença de sal de 800 mmol 1-1 pode ser relevante para a sobrevivência do microrganismo na pele humana, que tem uma mudança na concentração de sal dependendo da atividade da glândula écrina determinada pela taxa de exercício da pessoa e temperaturas ambientais. O(s) mecanismo (s) envolvido (s) no efeito cloreto de sódio não foram abordados. Sugere-se provisoriamente que o cloreto de sódio pode afetar a estrutura terciária da enzima e do substrato, ou ambos, para melhorar o acesso do local ativo das enzimas aos locais de clivagem específicos do substrato.
a explicação mais simples dos resultados observados é que em uma cultura sobrenadante de K. sedentarius existem duas enzimas degradantes do calo, serina proteases, que também solubilizam a queratina humana presente no calo. É possível que K. sedentarius produz uma protease, codificada por um gene, e que a atividade de protease autocatalítica ou outra produz duas enzimas de diferentes pesos moleculares. Alternativamente, existem dois genes que codificam duas enzimas independentes e intimamente relacionadas. A última hipótese é apoiada por um estudo anterior (Holland et al. 1992). Amostras de cultura contínua de K. sedentarius no estado estacionário em diferentes taxas de diluição analisadas na página, e sobrepostas com caseína, mostraram duas enzimas, uma constitutiva e a outra detectada em altas concentrações em baixas taxas de diluição. É importante ressaltar que, em taxas de diluição próximas ao µmax, não foi detectado. A determinação da sequência de aminoácidos N‐terminais dos polipeptídeos P1 (21 resíduos) e P2 (15 resíduos) mostrou-os totalmente diferentes. Este resultado, tomado junto com a informação da experiência contínua da cultura, sugeriria que as enzimas são codificadas independentemente.
os resultados desta investigação reforçaram a hipótese de que proteases específicas de K. sedentarius podem explicar a degradação do calo característico da ceratólise sem caroço. A evidência até o momento também sugere que duas proteases estão envolvidas e que são ativas no pH do local da pele, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). A interpretação dos resultados obtidos de experimentos in vitro para o ambiente In vivo pode ser questionada, embora o calo humano tenha sido usado como substrato. Idealmente, as biópsias da pele humana devem ser tomadas incluindo áreas da pele normal e sem caroço. A presença e localização ou ausência das proteases pode então ser determinada por técnicas histológicas usando anticorpos monoclonais como sondas para as proteases e K. sedentarius. No entanto, a aprovação ética não seria dada para biópsias do local necessário, o local de suporte do pé, de um número representativo de pessoas. O envolvimento de K. sedentarius na ceratitose sem caroço por um mecanismo de produção de proteases degradando a queratina não foi formalmente comprovado. No entanto, não há evidências que refutem as hipóteses e sua credibilidade foi fortalecida pelos resultados apresentados aqui. Fortes evidências in vitro foram apresentadas implicando K. sedentarius e suas enzimas degradadoras de calos extracelulares na condição ceratólise sem caroço. No pHs normal da pele e hidratação superficial, a produção e a atividade dessas enzimas serão baixas, sendo o P1 o mais ativo. Sob condições ambientais de oclusão e em hiperina pobre, o pH da pele se move para e ligeiramente acima da neutralidade. Estas condições favorecem a P2. Ambas as enzimas provavelmente eliminam enzimas, permitindo que K. sedentarius obtenha fontes de carbono e nitrogênio, pequenos peptídeos, bloqueados no polímero complexo residente e insolúvel, queratina. Atualmente, a regulação da produção dessas enzimas é desconhecida, assim como suas contribuições relativas à degradação do calo in vivo. Além das implicações clínicas, as proteases queratinolíticas têm um valor considerável para o setor comercial, pois são úteis em vários processos industriais, incluindo a degradação de queratina‐resíduos das indústrias de aves e couro (Shih 1993; Onifade et al. 1998). A alta atividade queratinolítica do K. as proteases de sedentarius a temperaturas e pH relativamente baixos, em comparação com muitas outras proteases, apresentam uma potencial aplicação dessas enzimas na indústria biotecnológica.
