peixe-zebra e de manutenção de estoques: peixe-zebra (Danio rerio) foram levantadas e organizadas de acordo com o estabelecido protocols30.Transgênicos linhas utilizadas foram Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(UAS:EGFP-UCHD)ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 e Tg(kdrl:EGFP)s84337. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de cuidados e uso de animais da filial de RIKEN Kobe (IACUC).Plasmídeos e oligonucleotídeos: Zebrafish marcksl1a, marcksl1b e fscn1a foram clonados por PCR a partir de cDNA de 1 embrião dpf usando NEB ® PCR Cloning kit. Todos os construtos de expressão utilizados neste estudo foram gerados através da clonagem Gateway® e / ou clonagem in-Fusion® usando plasmídeos de Tol2Kit38. Plasmídeos com marcksl1a mutado e Marcksl1b foram gerados usando Q5 ® site-Directed mutagenesis kit (NEB). os vetores contendo shRNA foram construídos por ligadura da sequência shRNA entre os locais EcoRI e PmeI a jusante do promotor U6 do vetor pEGFP-U6 modificado39 (um presente de Zuoshang Xu, plasmídeo de Addgene #19799). A sequência alvo para marcksl1 humano é 5 ‘- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. A sequência shRNA embaralhada 5′-GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ‘ foi projetada como uma sequência incompatível (sublinhada) de MARCKSL1 shRNA. Vetores contendo mouse Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) e Marcksl1-S120D/T148D/T183D (Marcksl1-DDD) subcloned em pEGFP-N1 (Clontech)10 foram presentes de Eleanor T. Coffey (Universidade de Turku). Informações detalhadas sobre plasmídeos e primers utilizados neste estudo podem ser encontradas nas tabelas complementares 1 e 2, respectivamente.
isolamento de RNA e síntese de cDNA: O RNA Total foi isolado usando o reagente TRI (epigenética) e o Kit Microprep de Rna direto-Zoltm (pesquisa Zymo) e o cDNA foi sintetizado usando o sistema de síntese de primeira fita sobrescrito III® (Invitrogen) de acordo com os protocolos do fabricante.
expressão Em Mosaico De Construções e linhas transgênicas de peixe-zebra: Construções de expressão baseadas em Tol2 (5-10 pg) foram co-injetadas em embriões de peixe-zebra de estágio de uma célula com 50 pg de mRNA tol2 transposase transcrito de vetor pcs-TP NotI-linearizado (um presente de Koichi Kawakami, Instituto Nacional de genética, Japão) usando o mMESSAGE mMACHINE SP6 kit (Invitrogen). Para a expressão em mosaico de transgenes, os embriões foram analisados em 1 ou 2 dpf após as injeções. Para gerar linhas Tg(fli1ep:MYL9B-EGFP)rk25 e Tg(fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26, embriões injetados foram criados para adultos e selecionados para fundadores.
geração de mutantes zebrafish marcksl1a e marcksl1b: mutantes marcksl1a foram gerados por mutagênese mediada por CRISPR/Cas9. Um RNA de guia único (sgRNA) visando o segundo exon (Fig. 4A) foi gerado usando protocolo independente de clonagem40. Cas9/sgRNA RNP complexo foi montado apenas antes da injeção e após 5 min de incubação em temperatura ambiente, 200 pg de Cas9 proteína (Invitrogen) e 100 pg de sgRNA foram co-injetado em uma célula fase Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 embrião. os mutantes marcksl1b foram gerados por mutagênese mediada por TALEN. TALEN visando o primeiro exon de marcksl1b (Fig. 4b) foi projetado usando TAL efetor nucleotídeo Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) e foram montados através do método Golden Gate 41. Os Di-resíduos variáveis de repetição de TALEN (RVDs) foram clonados em um vetor RCIscript-GoldyTALEN (Addgene) e mRNAs tampados para cada TALENs foram transcritos in vitro de plasmídeos de expressão SacI-linearizada usando mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Estágio de uma célula Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:os embriões de Ras-mCherry)s916 foram microinjectados com 200 pg de RNA (100 pg de cada mRNAs TALEN esquerdo e direito). F0 fundadores foram identificados pelo cruzamento TALEN ou CRISPR/Cas9 de injecção de peixe com o tipo selvagem de peixe e de triagem a prole para mutações em 2 dpf usando T7 endonuclease I (NEB) ensaio (para TALEN-injetado de peixe) ou sequenciação Sanger (para CRISPR/Cas9 de injecção de peixe). Resumidamente, o DNA genômico foi isolado de grupos de cinco embriões usando o método HotSHOT 42 e as regiões genômicas correspondentes foram amplificadas. As mutações foram avaliadas por sequenciamento direto de produtos de PCR purificados. A progênie F1 de F0 positivo foi aumentada para a idade adulta e os portadores heterozigotos para mutações foram identificados por recorte de barbatanas e análise de PCR de genotipagem de rotina usando os mesmos primers.Seis alelos mutantes em marcksl1a e cinco alelos mutantes em marcksl1b foram identificados durante a triagem (Fig. 13). O alelo rk23 abriga uma deleção de 2 nt que leva a um frameshift após o aminoácido 51 e códon de parada prematura no aminoácido 56 após 5 aminoácidos missensos(Fig. 4a, c). O alelo rk24 abriga uma deleção de 5 nt que leva a um frameshift após o aminoácido 13 e códon de parada prematura no aminoácido 17 após 4 aminoácidos missensos(Fig. 4b, d). Por essas razões, consideramos marcksl1ark23 e marcksl1brk24 como alelos nulos e focamos nossas investigações nas análises desses mutantes.
imagens vivas: os embriões foram montados em agarose de baixa fusão a 0,8% (Bio-Rad) em meio E3 contendo 0,16 mg/mL de Tricaína e 0,003% de feniltioureia. As pilhas z confocais foram adquiridas usando um microscópio confocal de disco giratório Olympus ix83/Yokogawa CSU-W1 invertido equipado com uma câmera CMOS Zyla 4.2 (Andor). Imagens de campo brilhante foram adquiridas no microscópio Leica M205fa. As imagens foram processadas usando Fiji (NIH).Ablação a Laser: ablações a Laser foram realizadas usando um laser de 405 nm (Andor) e módulo FRAPPA (Andor) montado em um microscópio confocal Olympus ix83/Yokogawa CSU-W1 invertido com um objetivo de imersão em água Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2. Três ablações sequenciais do laser com um tempo de permanência de 1000 µs cada foram aplicadas no poder do laser de 51%.
Microangiografia: a Microangiografia foi realizada em embriões de tipo selvagem, marcksl1ark23, marcksl1brk24 e marcksl1ark23; marcksl1brk24. Ao todo, 2 e 3 embriões dpf foram injetados com 1-2 nl dextran tetrametil rodamina ou dextran fluoresceína (MW = 2000 kDa, Invitrogen) a 10 mg/mL e fotografados imediatamente. As pilhas z confocais foram adquiridas com um objetivo Olympus UPLSAPO 10×/NA 0,4. Para cobrir todo o embrião, várias regiões foram fotografadas e costuradas usando o plugin de costura em Fiji43.
transplante de Células: os Grupos de 15 a 25 de doadores de células de marcksl1ark23;marcksl1brk24 mutante embriões em Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 de fundo foram coletadas a partir de uma posição aleatória no blastoderm e transplantadas para a lateral zona marginal no blastoderm44 de tipo selvagem destinatário de embriões em 4.5–6 hpf. A extração e o transplante foram realizados usando um Microinjector de óleo CellTram ® 4R (Eppendorf) com um capilar de vidro de borosilicato GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) Trabalhada com um extrator de micropipeta horizontal P-87 (Sutter Instrument Co.) e um microforge MF-900 (Narishige) para obter uma ponta lisa da forma da ‘colher’. Durante o transplante, os embriões foram mantidos em placas de petri revestidas de agarose com tampão 0,5 X E2 . Em 2 dpf, embriões com ISVs mcherry-positivos foram selecionados para microangiografia e imagem. Foram realizados oito transplantes independentes.
tratamentos químicos: a Latrunculina B (Merck Millipore) foi dissolvida em DMSO para 1 mg/ml e armazenada a -20 °C. CK666 (SIGMA) foi dissolvida em DMSO para 50 mM e armazenada a 4 °C. Todos os compostos foram diluídos na concentração desejada em tampão E3.
transfecção, knockdown proteico mediado por siRNA e experimento de tensão de cisalhamento: HUVECs (Lonza, C-2519A) foram cultivados em meio EGM (Lonza) e usados até a passagem 4. Para transfecções de plasmídeos, as células foram semeadas em meio Opti-MEM (Gibco) a 5,8 × 104 células/cm2 em lamelas revestidas de poli-L-lisina e gelatina e transfectadas com 2 µg de plasmídeo usando Lipofectamina 3000 (ThermoFisher Scientific). Duas horas após a transfecção, o meio Opti-MEM foi alterado para meio EGM sem antibióticos. Para a transfecção de siRNA, HUVECs (7.9 × 104 células / cm2) foram transfectadas com siRNA de 20 nM usando reagente DharmaFECT1 (Dharmacon). A transfecção foi repetida após 24 h. as células foram cultivadas por mais 24 h antes da extração ou fixação total do RNA. No TARGETplus humano MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (Dharmacon) foi usado para derrubar MARCKSL1. O pool Não-alvo do on-TARGETplus (Dharmacon) foi usado como transfecção de siRNA de controle. As células foram fixadas com PFA/PBS a 4%, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% e coradas com DAPI de 14 µM para rotulagem de núcleos, Alexa 568-faloidina (1:1000, Thermofisher Scientific) para visualização de f-actina e anticorpo anti-VE-cadherin (1:100, Sinalização Celular) seguido por anticorpo secundário anti-coelho Alexa 488 (1:1000, Thermofisher Scientific) para marcar junções EC.
para experimentos de tensão de cisalhamento, HPAEC (Lonza) foram cultivados em 1000-1500 células/mm2 em Prato revestido de gelatina a 1% em meio EGM-2 (Lonza) e usados antes da passagem 9. As células foram expostas a tensão de cisalhamento estática ou laminar a 15 dyn / cm2 por 0,5, 1 ou 6 h usando um aparelho do tipo placa paralela45, 46. Um lado da câmara de fluxo consistia em uma placa de vidro revestida com gelatina a 1% na qual os HPAECs cultivados descansavam e o outro lado consistia em uma placa de policarbonato. Suas superfícies planas foram mantidas separadas por 200 µm com uma junta de Teflon. A câmara recebeu uma entrada e uma saída para o fluido, e a entrada foi conectada a um reservatório superior com um tubo de silicone. A saída estava aberta para um reservatório inferior. O fluxo foi conduzido por uma bomba de rolo/tubo. O fluido (meio EGM-2) passou do reservatório superior através da câmara de fluxo para o reservatório inferior. A taxa de fluxo foi monitorada com um medidor de fluxo de tempo de trânsito ultrassônico (HT107, sistemas Transônicos) colocado na entrada, e foi controlado alterando a diferença de altura entre o reservatório superior e a saída da câmara de fluxo. A intensidade do estresse de cisalhamento (τ, estrondo/cm2) agindo sobre a CE camada foi calculado utilizando a fórmula: τ = 6µQ/a2b, onde μ é a viscosidade do perfusato (equilíbrio), Q é a vazão em volume (ml/s), e a e b são transversal dimensões do caminho de fluxo (cm). Após exposição ao estresse de cisalhamento, o RNA total foi isolado para qPCR.
PCR Quantitativo em tempo real: de acordo com pcr foi realizada utilizando 1 µL do cDNA, gerada a partir de 150 ng (HPAECs) ou 500 ng (HUVECs) do total de RNA, em 10 µL de mistura de reacção contendo 1X Luna Universal de acordo com pcr Master Mix (NEB) e 400 nM primers forward e reverse. As reações foram executadas no instrumento ABI Prism 7900HT em quadruplicado. Os dados foram analisados usando o software RQ Manager (Applied Biosystems) e a expressão relativa do mRNA MARCKSL1 foi calculada com o método 2−Δδct47 usando GAPDH como gene de referência.
hibridação in situ de montagem inteira: A hibridação in situ de montagem inteira foi realizada de acordo com o protocolo padrão48. Os embriões foram fixados em 4% de PFA em 24, 48 e 72 hpf e permeabilizados com 10 µg/mL de proteinase K. a hibridação foi realizada em tampão contendo 5% de sulfato de dextrano de sódio (MW = 500 kDa) a 70 °C durante a noite. Após a lavagem de stringência, os espécimes foram bloqueados com reagente bloqueador A 2% (Roche) em tampão de ácido maleico e incubados durante a noite com anticorpo anti-digoxigenina (DIG), conjugado com fosfatase alcalina (Roche, 1:5000) a 4 °C. os embriões foram corados com solução NBT/BCIP (Roche) em tampão de coloração . Os embriões foram limpos em 70% de glicerol durante a noite e fotografados usando o microscópio Leica M205fa. Os riboprobes longos MARCKSL1A e marcksl1b marcados com DIG de 1,2 kb foram gerados a partir de plasmídeos que codificam os cDNAs completos usando kits MEGASCRIPT SP6 ou T7 (Invitrogen).
sequenciamento de RNA de célula única: ECs foram isolados de embriões transgênicos TG (kdrl: EGFP)S843. A triagem celular foi realizada com FACSAriaII Cell Sorter (BD Bioscience). A suspensão de célula única foi carregada no sistema 10x Chromium e as bibliotecas cDNA foram construídas usando Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, Library e Gel Bead Kit v2 (10x Genomics) de acordo com o protocolo do fabricante. A Biblioteca foi sequenciada no sequenciador Illumina HiSeq 1500 (Illumina, EUA). O Cell Ranger v2. 1 foi usado para de-multiplexar arquivos de chamada de base bruta (BCL) gerados por sequenciadores Illumina em arquivos FASTQ, realizar o alinhamento, Contagem de código de barras e contagem UMI. As leituras de sequenciamento foram mapeadas para o conjunto do genoma do peixe-zebra (GRCz11, Ensembl release 92). Outras análises foram realizadas usando Seurat package49 em software R (https://www.r-project.org). As matrizes de expressão foram primeiro filtradas mantendo genes que são expressos em um mínimo de 3 células e células que expressaram um mínimo de 200 genes para análise a jusante. As células foram posteriormente filtradas selecionando para células que expressam baixo conteúdo mitocondrial (<7%). Os dados foram então normalizados usando Normalizadofunção de dados que normaliza a expressão gênica de cada célula pela expressão total.
quantificação do diâmetro dos vasos sanguíneos: Tg vivo(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg (KDR-l:Ras-mCherry)s916 transgênico wildtype ou marcksl1 embriões Mutantes foram fotografados em 50-52 hpf. As pilhas z Confocal foram adquiridas com um objetivo de imersão em óleo de silicone Olympus UPLSAPO 40×/NA1.25. Para cálculos de diâmetro DA E PCV, foram realizadas 4-5 medições entre ISVs ao longo da extensão da gema (ISVs no. 10-14). Para o diâmetro ISV, uma média de 6 medições foram feitas ao longo de cada ISV (ISVs no. 10-14) entre o DA e o DLAV. As medições foram feitas usando Fiji (NIH).
quantificação do número CE e proliferação: Para contagem do número da CE, 52 hpf tipo selvagem, marcksl1ark23, marcksl1brk24 ou marcksl1ark23;marcksl1brk24 embriões em Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 fundo, eram fixa em 4% PFA e corados com 3 µM DAPI. As pilhas z Confocal foram adquiridas com um objetivo de imersão em óleo de silicone Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Os núcleos foram contados em cada ISV (ISVs no. 9-22) entre o DA e o DLAV. Para quantificar ECs mitóticos em ISVs, wildtype ou marcksl1ark23;embriões marcksl1brk24 em TG(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:Ras-mCherry)fundo s916 foram fixados em 4% PFA em 30, 36 e 48 hpf, permeabilizados em 1% DMSO/1% Triton X-100 e corados com anticorpo anti-fosfo H3 (1:250, Merck Millipore) seguido por anticorpo secundário anti-coelho Alexa 488 (1:1000, ThermoFisher Scientific) e 3 µM DAPI. As pilhas z Confocal foram adquiridas com um objetivo de imersão em óleo de silicone Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Células mitóticas (células PH3-positivas) foram contadas em ISVs em ambos os lados do embrião (ISVs no. 9-22). Os ISVs foram visualizados usando fluorescência mCherry. Apenas uma célula PH3-positiva por ISV foi detectada independentemente da posição ISV. Durante a contagem, consideramos EC na telófase como uma única célula. Para contar o número de CE divisões, tipo selvagem ou marcksl1ark23;marcksl1brk24 embriões em Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 fundo, eram impressas a partir de 24 a 48 qps em 6 min de intervalos usando uma Olympus UPLSAPO 30×/NA 1.05 óleo de silicone objetivo de imersão. O número de divisões celulares em cada ISV (ISVs no. 11-15) foi quantificado.
quantificação dos níveis de actomiosina no córtex apical: Tg vivo (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Tg(fli1ep:EGFP-PLCδ1PH)rk26 e Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 embriões de peixe-zebra foram criadas à 30-34 hpf usando uma Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2 objetivo de imersão em água. A intensidade do Lifeact ou Myl9b ao longo do córtex apical e no citoplasma foi medida usando Fiji. Foi calculada a razão entre a intensidade cortical e citoplasmática média.
Análise in vivo da forma celular: a rotulagem unicelular de ECs em ISVs foi obtida pela expressão em mosaico de fli1ep:plasmídeo lynEGFP em wildtype, marcksl1brk24 ou marcksl1ark23;embriões mutantes marcksl1brk24 ou fli1ep:marcksl1b-plasmídeo EGFP em embriões de tipo selvagem. Em 2 dpf, a microangiografia foi realizada e os vasos foram fotografados com um Olympus UPLSAPO 60×/na 1,2 objetivo de imersão em água com intervalo de planos z ópticos de 0,25 µm. A análise de forma de célula de ECs de ISVs foi realizada de maneira semiautomática usando um script ImageJ escrito sob medida desenvolvido em Python, estendendo o método descrito em ref. 50. As imagens foram cortadas pela primeira vez grosseiramente para reduzir os requisitos de memória a jusante e metadados adicionais (tipo de vaso e identificador de embrião) foram preenchidos. Um script separado foi então executado para projetar e desembrulhar células ao redor de um vaso em uma superfície 2D. Resumidamente, as imagens cortadas foram giradas pela primeira vez com base no tipo de vaso para alinhar cruelmente o eixo do vaso com a direção Z em uma pilha de imagens, e o canal do rótulo da célula de mosaico fluorescente foi selecionado para projeção. Para superar problemas com a segmentação automatizada de vasos no canal de fluorescência do pool sanguíneo causado por estruturas de fundo fluorescentes variáveis e perfusão de dextran-rodamina fora do vaso, o eixo do vaso foi identificado definindo manualmente a posição do vaso aproximadamente a cada 10 µm através da pilha de imagens e, em seguida, realizando um Catmull-Rom spline ajuste e interpolação. Os dados foram então transformados para endireitar o eixo do vaso em três dimensões. Em seguida, a posição de intensidade máxima no canal de projeção foi identificada ao longo dos raios em intervalos de 1° ao redor do eixo do vaso. Essas informações foram usadas para projetar a intensidade de fluorescência em um plano onde os eixos estão posicionados ao longo do eixo do vaso e da posição angular, e para mapear a distância do eixo do vaso em cada posição no plano projetado. A célula foi identificada a partir da imagem projetada usando o método de Intermodes integrado do ImageJ. Os comprimentos de arco representados pelos lados de cada pixel associado à célula foram então calculados (\(l = \ frac {{2\pi rd^2}}{{360}}\), onde r é a distância entre o pixel associado à célula e o eixo do vaso e d é o lado de um pixel) e usado para gerar medidas de área de superfície da célula e proporção.
Análise in vitro da forma celular: HUVECs fixos foram fotografados com um objetivo de imersão em óleo de Silicone Olympus UPLSAPO 40×/NA 1.25. Ao todo, 10-20 imagens de cada deslizamento de capa foram tiradas para quantificação e analisadas de forma semiautomática usando um script ImageJ escrito sob medida. As pilhas z multicanal foram projetadas ao máximo e o canal que mostra um marcador GFP foi identificado a partir dos metadados do instrumento. O método de thresholding Otsu integrado do ImageJ foi usado para separar células de interesse do fundo; as imagens binárias resultantes foram limpas removendo regiões menores que 105 µm2 e regiões em contato com o limite do campo de visão. Uma etapa de intervenção manual subsequente permitiu ao usuário modificar opcionalmente regiões de célula de interesse com base nesta imagem binária para separar células mescladas erroneamente ou incluir células que foram perdidas pela operação de limite. O script então calculou áreas e perímetros para cada ROI de célula. Além disso, foi calculado Um “índice de spikiness” para cada célula com base na razão entre o perímetro da célula e o perímetro do casco convexo correspondente, e um valor para a razão de aspecto da célula foi calculado como a razão entre os eixos maior e menor de uma elipse ajustada ao ROI da célula.
Análise de blebbing de membrana: parcelas relacionadas ao blebbing de membrana foram geradas de forma semiautomática usando um script ImageJ escrito sob medida. Para cada membrana imageada, a razão entre o comprimento do contorno de uma borda da membrana e a distância euclidiana entre os pontos finais da borda foi calculada em cada ponto de tempo. A partir da série temporal resultante, as densidades espectrais de potência foram calculadas pelo método de Welch51. A densidade espectral de potência foi então calculada em média em uma janela de interesse, definida empiricamente como o tempo característico sobre o qual blebs se formaram (0,04–0,06 Hz); esses valores médios foram comparados entre experimental (marksl1b superexpressão) e condições de controle.
análise da dinâmica da actina e da miosina II em blebs: Os enredos relacionados à dinâmica da actina ou miosina em células blebbing foram gerados de forma semiautomática usando um script ImageJ escrito sob medida. As pilhas z de lapso de tempo multicanal foram projetadas ao máximo ao longo da dimensão Z. O software então identificou automaticamente a borda de um bleb entre dois pontos de ancoragem definidos pelo usuário em todos os pontos de tempo usando o método Otsu thresholding integrado da ImageJ em execução no canal Marksl1b-EGFP como um substituto para a rotulagem da membrana. Seguindo uma etapa de controle de qualidade do Usuário para garantir a identificação precisa da borda bleb, o perfil de intensidade do canal de actina/miosina ao longo da borda foi extraído em cada ponto de tempo e plotado contra o tempo em um kymograph. Em cada instante intensidade estatísticas foram extraídas junto com a bolha de área, definido aqui como o z-projetada a área delimitada pela borda e a linha que une os pontos em ambos os lados da bolha longe da bolha de ponta ao longo de um eixo perpendicular à linha que une o usuário-definido de pontos de ancoragem, e a média de actina/miosina canal intensidade e a bolha área foram plotados contra o tempo.
quantificação da densidade de actina cortical e largura do feixe: Imagens de alta resolução de actina em HUVECs foram adquiridas usando uma lente objetiva de óleo Plan-APOCHROMAT 63X montada em um microscópio confocal Zeiss Lsm880 equipado com um detector Airyscan e GaAsP. Aproximadamente regiões quadradas de 3 µm dentro de cada observação foram selecionadas aleatoriamente e cortadas tipicamente 8 seções ópticas cobrindo a malha cortical para fora dessas regiões. As imagens projetadas ao longo do eixo Z de pilhas cortadas foram geradas por projeção de intensidade máxima e submetidas ao seguinte procedimento. Como os filamentos de actina dentro da imagem eram ambíguos e era impossível avaliar toda a rede, quantificamos o número de filamentos de actina dentro das regiões limitadas como a densidade da malha de actina. Isso foi realizado definindo linhas de varredura ao longo dos eixos X e Y a cada 4 pixels, e os valores de pixel ao longo de cada linha de varredura foram submetidos ao Savitzky – Golay filter52 para calcular as derivadas de primeira ordem. Os filamentos de actina foram então identificados encontrando pontos de cruzamento zero, que são os picos de intensidade da linha de varredura. As contagens de picos foram divididas pelas contagens de pixels da linha de varredura (largura ou altura da imagem) e a densidade dos filamentos sobre a imagem foi calculada tomando-se a média desses valores.
para quantificar a largura do feixe de actina, as linhas centradas dos feixes de actina foram geradas encontrando pontos de cruzamento zero de derivados de primeira ordem calculados pelo filtro Savitzky-Golay e seguido pela aplicação do algoritmo de desbaste Hilditch. Para eliminar a possibilidade de que os pontos de ramificação ou cruzamento dos filamentos de actina afetem as medições, os pontos de ramificação encontrados dentro da linha esqueletizada foram eliminados e segmentados. O eixo ortogonal ao segmento geral foi determinado pela obtenção do autovetor, e as intensidades fluorescentes foram amostradas ao longo do eixo ortogonal que percorre o centro de gravidade do segmento com o método de interpolação Lanczos-5. Em seguida, o diâmetro de um filamento foi determinado pela largura da região que apresentou maior ou igual a metade da intensidade de pico dentro da linha amostrada ao longo do eixo ortogonal até o segmento geral.
estatísticas: a análise estatística foi realizada usando Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Os tamanhos das amostras não foram predeterminados, os experimentos não foram randomizados e os investigadores não foram cegos para a alocação durante os experimentos e avaliação dos resultados.
Resumo do relatório
mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo do relatório da Nature Research vinculado a este artigo.
