Nocautear e nocautear genes

nocautear genes
esta técnica permite a redução da expressão de um ou mais de anorganismo. Isto pode ocorrer através da modificação genética ou pelo tratamento com areagent tal como um ADN curto ou um oligonucleotide do RNA que tenha um sequencecomplementary ao gene ou a um transcrito do mRNA.
se a mudança na expressão gênica é causada por um oligonucleotídeo que se liga a um mRNA ou temporariamente a um gene, isso leva a uma mudança temporária na expressão gênica que não modifica o DNA cromossômico,e o resultado é referido como um “knockdown transitório”.
em um knockdown transitório, a ligação deste oligonucleotídeo ao activegene ou seus transcritos causa diminuição da expressão. A ligação pode ocorrer atravéso bloqueio da transcrição, a degradação da transcrição do mRNA(por exemplo. siRNA ou antisense dependente de RNase-H), ou através do bloqueio de tradução de mRNA, locais de emenda pré-mRNA ou clivagesitos de nuclease usados para maturação de outros RNAs funcionais, incluindo miRNA (e.g.by morpholino oligos).
o uso mais direto de knockdowns transitórios é para aprender sobre um gene quefoi sequenciado, mas tem uma função desconhecida. Esta abordagem experimental é conhecida como genética reversa. Os knockdowns transitórios são frequentemente usados na biologia do desenvolvimento porque os oligos podem ser injetados em zigotos unicelulares e estarão presentes nas células filhas da célula injetada.

a interferência do RNA (RNAi) é um meio de silenciar genes por meio da degradação do mRNA. Gene knockdownby este método é conseguido introduzindo interferingRNAs dobro-encalhados pequenos (siRNA) no citoplasma. Uma vez introduzidos na célula, os exogenoussiRNAs são processados pelo RISC. O siRNA é complementar ao targetmRNA a ser silenciado, e o RISC usa o siRNA como um modelo para localizar o mRNA thetarget. Depois que o RISC se localiza no mRNA alvo, o RNA é clivado bya ribonuclease.
RNAi é usado para análise funcional genética. O uso de RNAi pode ser útil emidentificar potenciais alvos terapêuticos, desenvolvimento de drogas ou outrasaplicações. Geneknockout (KO) é uma técnica genética em que um dos genes de um organismo é inoperante. Os organismos nocaute são usados para estudar a função gênica, geralmenteinvestigando o efeito da perda gênica. Kos heterozigotos e homozigotos: no primeiro, apenas um alelo é nocauteado, no último ambos os dois alelos são nocauteados.

a criação dirigida de um KO começa no tubo de ensaio com um plasmídeo,um cromossomo artificial bacteriano ou outra construção de DNA, eprocedendo à cultura celular. As células são transfectadas com o DNAconstruct. Muitas vezes, o objetivo é criar um animal transgênico que tem o gene alterado. Em caso afirmativo, as células estaminais embrionárias são geneticamente transformadas e inseridas em embriões precoces. Os animais resultantes com a mudança genética emsuas células germinativas podem então passar o nocaute do gene para futuras gerações.

o constructis projetado para recombinar com o gene alvo, que é feito porincorporando sequências do próprio gene para o construto.A recombinação ocorre então na região dessa sequência dentro do gene,resultando na inserção de uma sequência estranha para interromper o gene.
um nocaute condicional permite a deleção gênica de maneira específica do tecido ou do tempo. Isso é feito introduzindo locais de loxP ao redor do gene. As consequências serão introduzidas na linha germinativa através do mesmo mecanismo que o aknock-out. Essa linha germinativa pode então ser cruzada para outra CRE-recombinase que é uma enzima viral que pode reconhecer essas sequências, recombiná-las e excluir o gene flanqueado por esses locais.
como a recombinação do DNA é um evento raro, a sequência estrangeira escolhida parainserção geralmente inclui um repórter. Isto permite a seleção fácil ofcells ou indivíduos em que knockout foi bem sucedido. Às vezes, o DNAconstruct se insere em um cromossomo sem o homólogo desejadorecombinação com o gene alvo.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
é uma técnica pela qual a expressão de um gene é reduzida. Esta reduçãopode resultar de uma modificação do DNA ou de uma ligação de oligonucleotídeo ao mRNA ou ao gene. Nesse caso, a mudança de expressão é temporária, então wetalk sobre knockdown transitório.
uma das técnicas que permitem o knockdown transitório de um gene consiste no uso de oligômeros Morfolino. Eles se tornaram uma ferramenta padrão de knockdown em sistemas embrionários animais, então os Morfolinooligos são freqüentemente usados para investigar o papel de uma transcrição específica de mRNA emum embrião. Sua estrutura molecular tem bases de DNA ligadas a uma espinha dorsal de anéis de metilenemorfolina ligados através de grupos de fosforodiamidato. Os morfolinos bloqueiam o acesso de outras moléculas a pequenas sequências específicas (~25 bases) das superfícies de emparelhamento de base do ácido ribonucleico (RNA). Por causa de seus backbones completamente não naturais, os Morfolinos não são reconhecidos por proteínas celulares. As Nucleases não degradam os Morfolinos, nem são degradadas no soro ou nas células. Não há relatos publicados de Morfolinos ativando receptores toll-like ou respostas imunes inatas, como indução de interferon ou a resposta de inflamação mediada por NF-kB.Morfolinos não são conhecidos por modificar a metilação do DNA.Os Morfolinos não desencadeiam a degradação de suas moléculas de RNA alvo, ao contrário de muitos tipos estruturais anti-densos (por exemplo, fosforotioatos, siRNA). Em vez disso, Morfolinosact por “bloqueio estérico”, ligando-se a uma sequência alvo dentro de um RNA,inibindo moléculas que poderiam interagir com o RNA.
os Morfolinos também podem modificar o splicing do pré-mRNA ou inibir a tematuração e a atividade do miRNA.
Blockingtranslation
ligado à Região 5′ – untranslated do RNA mensageiro (mRNA), os Morfolinos podem interferir comprogressão do complexo de iniciação ribossômica da tampa 5 ‘ ao startcodon. Isso impede a tradução da região de codificação da transcrição direcionada (chamada geneexpression “derrubando”). Isso é útil experimentalmente quando um investigatorwishes conhecer a função de uma proteína específica; Morpholinos fornecer aconvenient meio de derrubar a expressão da proteína e de aprendizagem howthat knockdown alterações de células ou organismo.
Modificar pré-mRNA splicing
Morpholinoscan interferir com o pré-mRNA etapas de processamento por preventingsplice-dirigir pequeno nuclear ribonucleoproteins (snRNP) complexesfrom vinculação de suas metas nas fronteiras de íntrons em uma vertente ofpre-mRNA, ou bloqueando os nucleophilic-adenina-base e impedindo-a de formação de emenda lariatstructure, ou por interferir com a ligação de emenda regulamentar proteinssuch como emenda silenciadores e emenda enhancers. A prevenção da ligação de snRNP U1 (no local do doador) ou U2/U5 (na porção polipirimidina e no local do aceitador) pode causar emenda modificada, comumente excluindo exons do mRNA de natureza. A segmentação de alguns alvos de emenda resulta em inclusões de íntron, enquantoa ativação de sites de emenda enigmática pode levar a inclusões ou exclusões parciais.Os alvos dos snRNPs U11 / U12 também podem ser bloqueados. A modificação da tala pode ser avaliada de forma convencional por reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa (RT-PCR)e é vista como uma mudança de banda após eletroforese em gel de produtos RT-PCR.
nocaute
uma variação do nocaute genético tradicional é o nocaute genético condicional.
o nocaute condicional do gene é uma técnica usada para eliminar o gene aspecífico em um determinado tecido, como o fígado. Esta técnica é útilpara estudar o papel dos genes individuais nos organismos vivos. Difere do nocaute genético tradicional porque tem como alvo genes específicos em momentos específicosem vez de ser excluído do início da vida. Usando a técnica geneknockout condicional elimina muitos dos efeitos colaterais do nocaute genético tradicional. No nocaute genético tradicional, a morte embrionária de uma mutação genética pode ocorrer, e isso impede que os cientistas estudem o gene emadultos. Alguns tecidos não podem ser estudados adequadamente isoladamente, então o gene deveser inativo em um determinado tecido enquanto permanece ativo em outros. Com estetecnologia, os cientistas são capazes de nocautear genes em um estágio específicodesenvolvimento e estudar como o nocaute de um gene em um tecido afeta o samegeno em outros tecidos.
a técnica mais comumente usada é o sistema de recombinação Cre-loxrecombination. A enzima CRE recombinase reconhece especificamente os locais de twolox (loci de recombinação) dentro do DNA e causa recombinação entre eles. Esta recombinação causará uma deleção ou inversãodos genes entre os dois locais lox, dependendo de sua orientação. O gene Anentire pode ser removido ou inativado. Este sistema inteiro é induzível assim que o achemical pode ser adicionado para derrubar genes para fora em uma hora específica. Dois dos produtos químicos mais utilizados são a tetraciclina, que ativa a transcrição do gene da recombinase e do tamoxifeno, que ativa o transporte da proteína Crerecombinase para o núcleo. Apenas alguns tipos de células expressam a Crerecombinase e nenhuma célula de mamífero a expressa, portanto, não há risco de ativação acidental de locais de lox ao usar nocaute genético condicional em mamíferos.
um rato contendo o gene Cre e um rato contendoas sequências loxP são criadas para gerar um nocaute condicional para um particulargene de interesse. Os ratos não expressam naturalmente CRE recombinase ou loxsites, mas foram projetados para expressar esses produtos genéticos para criar a prole desejável. Você tem que obter um mouse no qual um exon importante é floxed (isso significa que ele tem aLox-P upstream e downstream) e um mouse que tem uma sequência Cre cuja expressão é regulada por um promotor específico do tipo de célula ou um promotor induzível. Em seguida, cruzar estes ratos e obter um mouse no qual as células não expressar Cre vai ter o gene com uma função normal, enquanto que as células que expressam Cre terá uma função dos genes interrompidos na porção entre Lox-P.
(Francesca Luca)

RNA interferrence mecanismo de

RNA de interferência (RNAi), anancient celular resposta antiviral, é um mecanismo natural para silenciar geneexpression. Pode ser explorado para permitir a inibição específica da função do gene anytarget. RNAi está provando ser uma ferramenta de pesquisa inestimável, ajuda na identificação de novos genes envolvidos em processos de doenças.

RNAi não é o único mecanismo desilenciamento da expressão gênica (Tabela 1).

Tabela 1: Comparaçãoentre diferentes métodos para silenciamento de genes.

a interferência de RNA (RNAi) ocorre em resposta à introdução de RNA de fita dupla (dsRNA)em uma célula. A introdução do dsRna desencadeia a ativação da proteína quinase-R dependente de dsrna (PKR). Activated PKR fosforilatos thetranslation initiation factor EIF2: este efeito, em associação com a activação da Rnase-L e indução da produção de interferão, interrompe a síntese de proteínas e promove a apoptose. No geral, acredita-se que isso represente um antiviromecanismo de defesa. Rnaié um mecanismo altamente conservado em todas as espécies taxonômicas . Além detem uma atividade antiviral, acredita-se também que o RNAi suprime a expressão de segmentos potencialmente prejudiciais do genoma, como transposons, que podem desestabilizar o genoma agindo como mutagênicos insercionais.

embora seus mecanismosnão sejam totalmente elucidados, o RNAi representa o resultado de um processo de várias etapas(Figura 1). Ao entrar na célula, os dsRNAs longos sãoprimeiro processado pelo Dicer da enzima RNase III. Este dímero funcional contémshelicase, ligação dsRNA e domínios PAZ (suas funções não são completamentelucidados). Dicer produz 21-23 nucleotídeo dsrna fragmentos com doisonucleotídeo 3 ‘ saliências finais, ou seja, siRNAs. RNAi é mediado pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) que, guiado por siRNA, reconhece mRNA contendo asequência homóloga ao siRNA e cliva o mRNA em um local localizadoaproximadamente no meio da região homóloga. Assim, a expressão gênica éespecificamente inativada em um nível pós-transcricional.

Em C. elegans, Dicer foi mostradopara interagir com as proteínas rde. As proteínas do rde ligam ao dsRNA longo e arebelieved para apresentar o dsRNA longo ao Dicer para processar. Mutantes exibindo um alto grau de resistência ao RNAi foram relatados como possuindo mutações atrde-1 e RDE-4 loci.

Figura 1: Mecanismo de RNAinterference

A aparência de doublestranded (ds) RNA dentro de uma célula (por exemplo, como consequência de uma infecção viral)desencadeia uma complexa resposta, que inclui, entre outros fenômenos (por exemplo,produção de interferon e suas conseqüências) uma cascata de eventos moleculares conhecidoscomo RNAi. Durante o RNAi, a enzima celular Dicer se liga ao dsRNA e se cliva em pedaços curtos de ~ 20 pares de nucleotídeos de comprimento conhecidos como SMALLINTERFERING RNA (siRNA). Esses pares de RNA se ligam à enzima celular chamado complexo de silenciamento induzido por drna (RISC) que usa uma fita do siRNA para bindto moléculas de RNA de fita simples (ou seja, mRNA) de sequência complementar. A atividade da enuclease do RISC degrada então o mRNA, assim silenciando a expressão do gene viral. Da mesma forma, acredita-se que a maquinaria genética das células toutilize RNAi para controlar a expressão de mRNA endógeno, adicionando assim uma nova camada de regulação pós-transcricional. O RNAi pode ser explorado nas configurações experimentais para derrubar genes-alvo de interesse com uma tecnologia específica e relativamente fácil (veja o texto para mais detalhes).

além da genesilenciação, o RNAi pode estar envolvido em outros fenômenos de regulação gênica.. Itappears que RNAi pode igualmente funcionar metilando citosinas assim como CpGsequences mais classicamente associado com a metilação. Se o alvo sequênciahares homologia com um promotor, silenciamento transcricional pode ocorrer viametilação. Além disso, o RNA parece interagir com os domínios da cromatina, quepode, em última análise, direcionar a metilação do DNA. Estudos de C. elegans mostraram que o RNAi pode se espalhar entre as células por meio de mecanismos que podem não depender do siRNA.O locus sistêmico deficiente em interferência de RNA (sid), sid-1, codifica um conservedprotein com uma sequência de peptídeos de sinal e 11 domínios transmembrana putativos,sugerindo que a proteína sid-1 pode atuar como um canal para dsRNA longo, siRNA ou um sinal atualmente não descoberto relacionado ao RNAi. Mutantes Sid-1 retaincell-RNAi autônomo, mas não conseguem mostrar a disseminação do RNAi. Permanece inclearwhether este RNAi sistemático ocorre nos mamíferos, embora uma similaridade forte seja relatada entre o sid-1 e as proteínas humanas e previstas do rato.

(Justine Floret)

fonte : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang = “en-gb” xml:lang = “en-gb”>

ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

essas três tecnologias moleculares permitem editar o genoma de maneira específica do local, cada técnica com um mecanismo diferente. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e as nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs) são nucleases quiméricas compostas por módulos programáveis de ligação de DNA específicos de sequência ligados a um domínio de clivagem de DNA não específico. ZFNs e TALENs permitem uma ampla gama de modificações genéticas, induzindo quebras de fita dupla de DNA que estimulam a junção de extremidade não homóloga propensa a erros ou reparo direcionado à homologia em locais genômicos específicos.

Imagem tirada do http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

A versatilidade de ZFNs e TALENs surge a partir da capacidade de personalizar o DNA-domínio de ligação para reconhecer praticamente qualquer sequência. Esses módulos de ligação ao DNA podem ser combinados com vários domínios efetores para impactar a estrutura e a função genômica, incluindo nucleases, ativadores e repressores transcricionais, recombinases, transposases, metiltransferases de histona de DNA e acetiltransferases de histona. Assim, a capacidade de executar com sucesso alterações genéticas depende em grande parte da especificidade de ligação ao DNA e afinidade de proteínas projetadas de zinco-dedo e conto.

proteínas do dedo de zinco Cys2-His2

o domínio do dedo de zinco Cys2-His2 está entre os tipos mais comuns de motivos de ligação ao DNA encontrados em eucariotos e representa o segundo domínio de proteína codificado com mais frequência no genoma humano. Um dedo de zinco individual consiste em aproximadamente 30 aminoácidos em uma configuração ββα conservada. Vários aminoácidos na superfície Da α-hélice normalmente entram em contato com três pares de bases no sulco principal do DNA, com diferentes níveis de seletividade. A estrutura modular das proteínas do zinco-dedo fez – lhes uma estrutura atrativa para o projeto de proteínas ADN-obrigatórias feitas sob encomenda. A chave para a aplicação de proteínas de dedo de zinco para reconhecimento de DNA específico foi o desenvolvimento de matrizes não naturais que contêm mais de três domínios de dedo de zinco. Este avanço foi facilitado pela descoberta baseada na estrutura de uma sequência de vinculadores altamente conservada que permitiu a construção de proteínas sintéticas de zinco-dedo que reconheciam sequências de DNA de 9 a 18 bps de comprimento. Como 18 bps de sequência de DNA podem conferir especificidade dentro de 68 bilhões de bp de DNA, esse método permitiu que sequências específicas fossem direcionadas ao genoma humano pela primeira vez.

efetores semelhantes a Ativadores de transcrição

contos são proteínas que ocorrem naturalmente do gênero de bactérias patogênicas de plantas Xanthomonas e contêm domínios de ligação ao DNA compostos por uma série de 33-35 domínios de repetição de aminoácidos que cada um reconhece um único pa. A especificidade do conto é determinada por dois aminoácidos hipervariáveis que são conhecidos como diresíduos variáveis repetidas (RVDs) . Como os dedos de zinco, as repetições modulares do conto estão ligadas entre si para reconhecer sequências de DNA contíguas. No entanto, em contraste com as proteínas dos dedos de zinco, não houve reengenharia da ligação entre repetições necessárias para construir longas matrizes de contos com a capacidade de abordar teoricamente locais únicos no genoma. Além de seu papel na facilitação da HDR (recombinação direta homóloga), as nucleases específicas do local também permitem a rápida geração de linhagens celulares e organismos com fenótipos nulos; O reparo mediado por NHEJ de um DSB induzido por nuclease leva à introdução de pequenas inserções ou deleções no local alvo, resultando em nocaute da função do gene por meio de mutações de deslocamento de quadro.

Imagem tirada do http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

Distinta do site-specific nucleases descrito acima, o CRISPR (Cluster de Regulamentação Espaço Curto Palíndromo Repete)/CRISPR-associado (Cas) do sistema surgiu recentemente como um potencial fácil e eficiente alternativa para ZFNs e TALENs para a indução do alvo alterações genéticas. Nas bactérias, o sistema CRISPR fornece imunidade adquirida contra a invasão de DNA estranho por meio de clivagem de DNA guiada por RNA. No sistema CRISPR/Cas Tipo II, segmentos curtos de DNA estranho, denominados “espaçadores”, são integrados nos loci genômicos CRISPR e transcritos e processados em RNA CRISPR curto (crRNAs). Estes crRNAs recozem aos crrnas trans-ativadores (tracrRNAs) e à clivagem sequência-específica direta e ao silenciamento do ADN patogénico por proteínas de Cas. Um trabalho recente mostrou que o reconhecimento do alvo pela proteína Cas9 requer uma sequência de “semente” dentro do crRNA e uma sequência de protospacer adjacente contendo dinucleotídeo conservada (Pam) a montante da região de ligação ao crRNA. O sistema CRISPR / Cas pode, assim, ser redirecionado para clivar praticamente qualquer sequência de DNA, redesenhando o crRNA. Significativamente, o sistema CRISPR/Cas demonstrou ser diretamente portátil para células humanas por co-entrega de plasmídeos expressando a endonuclease Cas9 e os componentes crRNA necessários.

imagem tirada de https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php