O fator 2 semelhante a Kruppel (KLF2) regula a ativação pró-inflamatória de monócitos

resultados

a expressão de KLF2 é reduzida com ativação/diferenciação de monócitos em macrófagos.

para entender melhor o papel do KLF2 na regulação de células imunológicas, como monócitos/macrófagos, primeiro avaliamos a expressão de KLF2 em monócitos humanos primários. Como mostrado na Fig. 1 a esquerda, a expressão de KLF2 é robusta em monócitos humanos primários e fortemente reduzida com diferenciação em macrófagos após 5 dias. A expressão de KLF2 na linha de células monocíticas humanas THP-1 foi muito menor do que a dos monócitos humanos primários. No entanto, a expressão foi ainda reduzida após o tratamento dessas células com LPS ou 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato, dois agentes bem estabelecidos para induzir ativação ou diferenciação celular (Fig. 1 A Direita).

em seguida, procuramos determinar se a expressão de KLF2 é regulada no cenário inflamatório in vivo. A ativação monocítica é um evento fisiopatológico chave no desenvolvimento da aterosclerose, uma condição inflamatória crônica de baixo grau, por isso raciocinamos que a expressão de KLF2 pode ser reduzida nesses pacientes (11). Examinamos um grupo de 14 indivíduos normais pareados por idade e 14 pacientes com aterosclerose extensa (≈50% com história de revascularização da artéria coronária) que são estratificados pelos níveis mais baixos e mais altos de gene de osteossarcoma de Finkel–Biskis–Jinkins (FOS), respectivamente, que demonstrou servir como um marcador de inflamação (12). Como mostrado na Fig. 1 B, A expressão de KLF2 foi significativamente reduzida em ≈30% nos pacientes. Em contraste, nenhum efeito significativo foi observado para KLF3, KLF6, KLF11, e KLF13. Consistente com nosso estudo anterior, a expressão de FOS foi significativamente aumentada em pacientes com doença arterial coronariana (12).

KLF2 inibe a ativação de monócitos e a capacidade fagocítica.

em resposta a estímulos inflamatórios, os monócitos expressam níveis aumentados de fatores pró-inflamatórios e citocinas/quimiocinas e exibem maior capacidade fagocítica. Para obter informações sobre o papel do KLF2 na função monocitária, realizamos estudos de superexpressão. As células THP-1 foram infectadas com vírus vazio de controle (EV) ou KLF2 (Ad-KLF2) por 24-48 h E então estimuladas com LPS por 2 e 6 h. como mostrado na Fig. 2 A, o tratamento de células infectadas com EV com LPS (25 ng/ml) resultou em uma indução robusta de ciclooxigenase (COX)-2, fator tecidual e proteína quimioattractante de monócitos (MCP)-1 mRNA. Em contraste, essa indução foi marcadamente atenuada em células infectadas com KLF2 (Fig. 2 A). Efeitos semelhantes também foram observados na linhagem celular de monócitos de camundongo J774a (dados não mostrados). Além disso, a superexpressão de KLF2 inibiu fortemente a secreção de várias citocinas e quimiocinas. Como mostrado na Fig. 2 B, KLF2 sobreexpressão atenuado a LPS-mediada da indução de fatores, tais como CD40L (por 49.6%), macrófagos inflamatórios proteína 1α (48.4%), macrófagos inflamatórios proteína 1β (64.2%), IL-1β (55.0%), IL-8 (79.1%), o TNF-α (50.2%) e MCP-1 (68.8%). Este efeito foi especial porque nenhum efeito significativo foi observado nos níveis de vários outros relevantes fatores de crescimento (tgf-β1, derivado de plaquetas fator de crescimento, e de granulócitos/macrófagos, o fator estimulador de colônia), citocinas/quimiocinas (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1 α e IFN-γ), ou matriz de alteração de enzimas (metaloproteinase de matriz tipos 1, 2, 3, 9) (dados não apresentados).

uma característica clássica do monócito/macrófago ativado é a fagocitose. Para determinar se KLF2 sobreexpressão afeta o fagocitárias capacidade de monócitos, nós overexpressed KLF2 ou de controle (EV) em THP-1 células, estimuladas com LPS, e avaliada a capacidade destas células para ocupar Texas red marcado por zymosan Um bioparticles. Como mostrado na Fig. 2 C, controle de células infectadas por vírus ingeridas as biopartículas de zimosano. Em contraste, a absorção por monócitos que expressam KLF2 foi marcadamente reduzida (Fig. 2 C). Em conjunto, esses dados demonstram que o KLF2 pode inibir a secreção de monócitos de citocinas / quimiocinas e fagocitose.

KLF2 não inibe o recrutamento de monócitos.

em seguida, procuramos avaliar o efeito do KLF2 na função monocitária in vivo. Em resposta a uma lesão ou estímulo inflamatório, os monócitos são recrutados da corrente sanguínea para os tecidos. Primeiro, realizamos estudos para avaliar se o recrutamento de monócitos foi alterado pela expressão de KLF2. Para minimizar a contribuição de outros tipos de células, usamos camundongos C. B-17-SCID-bege que são deficientes em T, B e células assassinas naturais. Esses animais (n = 5 por grupo) foram então submetidos à irradiação total do corpo e reconstituídos com células j774a adenoviralmente infectadas com vírus de controle (EV) ou KLF2 por meio de injeção da veia da cauda (descrito em materiais e métodos). Os animais foram então submetidos à injeção de tioglicolato (um potente irritante químico que induz o recrutamento de monócitos), e o número de células GFP-positivas foi avaliado 48 h mais tarde por análise citométrica de fluxo. Como mostrado na Fig. 2 C E D, KLF2 não inibiu o recrutamento de monócitos GFP + J774a para a cavidade peritoneal. De fato, observamos reprodutivelmente que os animais transduzidos com KLF2 exibiram um aumento significativo nas células GFP+. Esses dados sugerem que o KLF2 não inibe, mas aumenta o recrutamento monocítico para um local inflamatório.

KLF2 inibe a inflamação induzida pela carragenina.

após o recrutamento e migração para os tecidos, os monócitos secretam citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento para perpetuar a resposta inflamatória. Como mostrado na Fig. 2 B, observamos que a superexpressão KLF2 atenuou a elaboração de várias citocinas e quimiocinas. Para determinar se KLF2 afeta a função pró-inflamatória monocítica, usamos um modelo bem estabelecido para inflamação: injeção de footpad induzida por carragenina. A injeção deste produto químico demonstrou induzir reprodutivelmente uma resposta inflamatória caracterizada por edema da pata (13-15). C. B-17-Scid-bege ratos (n = 4 por grupo) foram irradiados, como descrito acima, reconstituído com controle ou KLF2-expressão de células J774a, e, em seguida, desafiou com a injeção de carragenina na pata (descrito em Materiais e Métodos). O volume da pata foi determinado usando um hidropletismo modificado para pequenos volumes (Ugo Basile, Milão). Como mostrado na Fig. 2 f, animais infectados com EV exibiram um aumento de 17 ± 1,08-mm3 e 23,3 ± 3,05-mm3 no volume da pata após 1 e 2 h de injeção de carragenina, respectivamente. Em contraste, os animais reconstituídos com células j774a que expressam KLF2 exibiram apenas um aumento de 6,25 ± 0,85-mm3 e 7,5 ± 0,95-mm3 no volume da pata em 1 e 2 h após a injeção de carragenina, respectivamente (Fig. 2 F). Consistente com esse efeito grosseiro, a análise histológica das patas revelou extravasamento reduzido de fluidos, o que leva à formação de edema (Fig. 2 g, setas).

efeito do Knockdown KLF2 na expressão genética inflamatória.

para determinar a importância do KLF2 na expressão gênica inflamatória monocítica, pequenos estudos de knockdown mediados por Rna interferente (siRNA) também foram realizados. Como mostrado na Fig. 2 H, em comparação com células tratadas com siRNA não tratadas (controle) e inespecíficas, knockdown de KLF2 (≈60% knockdown) em células J774a resultou em uma indução de genes inflamatórios como MCP-1 e um efeito mais modesto nos níveis de expressão do fator COX-2 e tecidual. Esses resultados também foram verificados com análise PCR em tempo real (Fig. 2 I).

KLF2 inibe as atividades do Promotor NF-kB e AP-1.

KLF2 pode inibir potentemente a indução mediada por LPS de MCP-1, COX-2 e fator tecidual (Fig. 2 A). Sabe-se que a indução desses alvos por estímulos pró-inflamatórios é regulada por vias transcricionais, como NF-kB e AP-1. Raciocinamos que, em princípio, o KLF2 pode inibir essas vias em vários níveis, como expressão, ligação ao DNA ou indução da atividade transcricional.

primeiro nos concentramos no NF-kB, dado seu papel central na inflamação. A superexpressão de KLF2 não alterou o acúmulo nuclear de P65 ou os níveis nucleares de IKB quinase (IKK) α e IKKy (Fig. 3 A). Além disso, a superexpressão KLF2 não alterou a cinética da fosforilação ou degradação de IkB ou os níveis citoplasmáticos de IKKa, IKKß e IKKy (Fig. 3 B). Consistente com essas observações, o KLF2 não afetou a ligação do NF-kB ao DNA. Como mostrado na Fig. 3 C, Tratamento de células infectadas pelo vírus de controle (EV) com LPS induziu uma única banda principal. Estudos de competição e supershift verificaram que essa banda representa NF-κΒ. Um padrão quase idêntico de ligação NF-kB foi observado em células de superexpressão KLF2. Para avaliar se o KLF2 pode afetar a ativação transcricional mediada por NF-kB, foram realizados ensaios de repórter de genes. Como mostrado na Fig. 3 D, transfecção de p65 com um plasmídeo repórter luciferase NF-kB induziu atividade transcricional por ≈11 vezes. Esta indução foi fortemente reduzida na presença de KLF2, indicando que KLF2 inibe a atividade transcricional NF-kB. Efeitos semelhantes de KLF2 foram observados para a via AP-1 (Fig. 5 A-C, que é publicado como informação de apoio no site da PNAS).

Recrutamento do fator associado ao COATIVADOR CBP (PCAF) pela KLF2 como mecanismo unificador.

tomados em conjunto, os resultados na Fig. 3 indicam que KLF2 pode inibir a transativação mediada por NF-kB independente dos efeitos na ligação do DNA desses fatores. Um possível mecanismo é o recrutamento de coativadores críticos. Por exemplo, a ligação ideal de NF-kB requer interação com vários coativadores-chave, como coativador de receptor de esteróide (SRC)-1, PCAF e P300/CBP. O KLF2 pode interagir com um ou mais desses fatores, recrutá-los para longe do NF-kB e, como conseqüência, reduzir a atividade transcricional mediada pelo NF-kB.

para determinar o papel da PCAF na inibição mediada por KLF2 da atividade transcricional NF-kB, realizamos estudos de cotransfecção com pcaf exógeno. Transfecção de PCAF (mas não p300; dados não mostrados) resgataram significativamente a repressão mediada por KLF2 do concatemer NF-kB (Fig. 4 A). Um resgate parcial também foi observado na capacidade do KLF2 de inibir a atividade transcricional AP-1 (Fig. 5D). Para determinar se KLF2 e PCAF interagem uns com os outros, realizamos ensaios de pull-down e coimmunoprecipitação GST. Usando produtos transcritos e traduzidos in vitro, descobrimos que KLF2 e PCAF podem interagir diretamente em um sistema livre de células (Fig. 4 B). Para saber se o PCAF se liga ao KLF2 in vivo, superexpressamos KLF2 (marcado com hemaglutinina) e PCAF (marcado com sinalizador) em células COS-7. A imunoprecipitação com um anticorpo anti-bandeira seguido de Western blotting com um anticorpo anti-hemaglutinina mostrou que o KLF2 se liga ao PCAF nas células (Fig. 4 C).

para determinar se os mecanismos subjacentes aos efeitos observados são operativos in vivo, realizamos estudos de imunoprecipitação de cromatina (ChIP). Como esperado, a estimulação LPS de células THP-1 levou ao recrutamento de p65 e PCAF para o promotor COX-2 (Fig. 4 D). Além disso, acetilação concomitante de HH3 e HH4 foram observadas. No entanto, no contexto da superexpressão KLF2, o recrutamento de PCAF e a acetilação de histonas são fortemente atenuados (Fig. 4 D). Consistente com nossos ensaios de mudança de gel, nenhum efeito significativo do KLF2 foi observado no Recrutamento do P65.