RNA Total foi extraído usando o Reagente De Isolamento Tripure (Roche).
amostras de RNA foram tratadas com DNaseI sem RNase e purificadas usando o Rneasy Mini Kit (QIAGEN). O RNA resultante foi esgotado do RNA ribossômico usando o Kit de remoção de rRNA Ribo-Zero (humano/Rato / Rato) (epicentro). O RNA rRNA-empobrecido foi usado para sintetizar o primeiro cDNA da Costa usando o sistema da síntese da primeira costa de SuperScript® III (Invitrogen) de acordo com as instruções dos fabricantes. Posteriormente, a segunda fita foi gerada usando E. coli DNA ligase (Invitrogen), E. coli DNA polimerase (Invitrogen), e dUTP, dCTP, dATP, e dGTP set (10 µmol cada, Promega), no Segundo Strand Buffer (Invitrogen). Em seguida, o cDNA foi cortado com Covaris para cerca de 300bp. Após a fragmentação, as amostras foram purificadas com colunas Minelutas (Qiagen). E as extremidades salientes de 3′ e 5′ dos fragmentos foram reparadas usando T4 DNA polimerase (NEB) e T4 DNA Polinucleotídeo quinase (NEB) em tampão de ligase de DNA T4 (NEB). Em seguida, as extremidades dA foram geradas empregando fragmento Klenow (3′->5′ exo-, NEB), no Buffer 2 (NEB). As reações de ligadura do adaptador foram então configuradas usando adaptadores indexados e Ligase rápida (NEB). Os produtos foram utilizados como modelo para o tratamento de UNG (Fermentas) e amplificação por PCR utilizando a polimerase de DNA de Alta Fidelidade de Phusion (NEB). As bibliotecas foram visualizadas em géis de Agarose de Uso Geral e-Gel® a 2% (Invitrogen). As bibliotecas com código de barras foram sequenciadas em uma única faixa de um Hiseq2500 (Illumina).
